专利名称:一种固相制备核酸分子克隆的方法
技术领域：
本发明涉及一种分子克隆技术，特别涉及一种固相制备核酸分子克隆的技术。
二背景技术：
人类基因组(测序)计划已经完成，后基因组计划已步入实施。研究基因在生命过程中的功能，也就是功能基因组学，成为全世界生命科学工作者共同的课题。功能基因组研究的目的是要认识基因组中每个核酸的生物学含义，发现疾病易感基因。功能基因组的研究途径是比较基因组学，即通过比较和分析不同表型个体之间基因组序列差异，解码基因组中每个核酸的生物学意义，发现功能基因，识别与疾病相关的分子遗传信息。进一步地，根据个体基因组信息，实现疾病的预测、预防和个体化治疗。随着功能基因组研究的发展以及人们对提高医疗健康水平的不懈追求，“个体化医疗”已开始进入人们的生活。为了真正实现“个体化医疗”这一目标，首先要对每个人的基因组进行再测序，找出不同个体在DNA序列上的差异与不同疾病、发育等的相关性。采用目前的测序技术进行大规模个体全基因组DNA的测序，即对大量的人类个体的基因组DNA(包含有30亿碱基)进行再测序，其成本仍太高。这严重地限制了功能基因组的研究进展，影响到人类基因组计划的研究成果的应用。而对于目前的基因组测序成本而言，“个体化医疗”仍然是人类的一个遥远的梦想。因此，快速、经济地对大量个体全基因组进行测序成为当今挑战科学家的一项重大课题，人们急需发展出一些快速、廉价的个体化基因信息检测技术来解决目前所存在的问题。这有利于人们更加深入地从分子层次上认识生命过程的机理，从根本上认识疾病产生的根源，在分子层次上进行疾病的预测、诊断和治疗，将会使医学临床实践产生革命性的变化。
传统的测序方法，如1998年推出的ABI Prism3700 DNA自动化测序仪以及ABI Prism3730 DNA测序仪，测序时间长花费大。主要有两个原因，首先是模板制备。传统的模板制备方法是将待测基因组分成许多片断，然后将每个片断插入克隆载体，转化大肠杆菌后平板培养，挑取克隆，扩大培养后提取质粒，然后送测序仪测序。因为在挑取大肠杆菌克隆的过程中，每次挑取的克隆都很有限，而且操作烦琐，需要投入大量的人力物力和财力。其次是测序过程。由于测序样本都是单个克隆，每台机器一次只能测序96个样本，因此要测序30亿碱基的人类基因组序列，需要耗费大量的时间及测序用药品试剂，从而导致人类基因组测序时间长、耗费大，无法实现个体化测序。有人统计，采用ABI Prism3730 DNA测序仪测序，平均每个碱基的成本是0.008美元，完成一个30亿碱基的测序，需要150台ABI Prism3730 DNA测序仪运转一年，测序成本达到二千四百万美元。
在对传统基因测序方法进行改进的过程中，美国454公司首先推出了一种新的测序方法。该方法将DNA测序成本降至目前成本的100倍。该技术目前已成功进入市场化运作。该方法基于焦磷酸测序与高通量模板制备两个重要技术，其中高通量模板的制备对于成本的降低及测序速度的提高起了重要的决定性作用。该公司将微球固定技术、linker-PCR与乳液PCR技术相结合，能够通过一次PCR扩增，同时将大量的待测序模板克隆出来并固定在不同一个微球上，然后再将单个微球固定在一个凹槽内，形成高密度的微球阵列，然后进行高通量并行测序。该方法虽然将测序技术往前推进了一步，但仍然存在着一些问题，如模板制备较为烦琐，条件较难控制，成本较高等。而且该技术离生物科学家们提出的一千美元人类基因组测序的目标还有相当大的差距。在改进454测序技术的过程中，许多科学家想到了应用生物芯片技术制备测序模板，如Solexa公司采用生物芯片上进行桥式PCR扩增，但这些技术都较难控制反应条件，而且对基片处理具有较高的要求。
DNA测序模板制备技术发展的历史也是核酸分子克隆技术的发展史。本发明针对目前DNA测序模板制备存在的技术瓶颈，提出了一种固相制备核酸分子克隆的新技术。该发明改进了目前分子克隆的制备技术，可用于高密度基因芯片制作及全基因组测序模板的制备，具有十分重要的应用前景和使用价值。本发明不仅可用于高通量低成本测序模板的制备，同时还可以用于SNP检测以及DNA甲基化检测技术的改进，从而使人们能够获取大量的生物分子信息。
三
发明内容针对上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种固相制备核酸分子克隆的技术。
本发明的技术解决方案为一种固相制备核酸分子克隆的技术，制备步骤为通过现有技术制备单链环形核酸待克隆模板；设计模板引物，引物5’端修饰有丙烯酰胺基团、氨基、醛基、或生物素等化学基团，这些修饰化学基团的引物可向生物技术公司(如英骏生物技术有限公司)订购；根据模板引物5’端修饰的基团或下一步的用途，对基片的表面进行相应的硅烷化、氨基化、醛基化等处理、或亲和素等修饰。基片部分具体的修饰方法见实施例。修饰后的基片有两种用途，一种是直接用作固相载体，也就是修饰在基片上的基团与引物修饰基团发生化学或生物反应后，将引物牢固地固定在基片上。另一种基片是用来铺上一层聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶等网状多孔的固相支持物，其中引物能够直接与该凝胶固相支持物中的生物化学基团或埋在该支持物中的微球表面的生物化学基团发生反应，牢固地将引物固定在凝胶固相支持物中或微球表面；将所得模板和其他没有固定的引物加入到固相支持物中，再加入相应的生物酶及相应的反应缓冲液和核酸单体等，利用超支滚环扩增法进行扩增，形成单一的核酸分子克隆；最后将互补自由链去除。
其中，该技术方案中使用的微球可以是由金属及金属氧化物制成，如磁珠。在微球表面修饰一层化学基团或生物基团，表面修饰有基团的磁珠可直接从Dynal Biotech公司购买。另外，该技术方案中使用的微球也可以是由塑料、橡胶、尼龙制成的固体微粒，微粒表面修饰一层化学基团或生物基团，如美国的Lumirex公司生产的聚苯乙烯微球颗粒，该公司提供表面上化学基团修饰的产品。
该技术的特点之一是固相分子克隆的制备，即模板的引物上的化学基团能够与固相载体上的化学基团产生化学反应或生物反应，使全部引物或部分引物牢固地固定在固相载体上。从而使滚环的产物能够固定在固体的基片上。
该技术方案采用了固相超支滚环扩增反应，同一模板的扩增产物都集中在一个点附近有限的范围内，因而没有其他克隆产物的污染。本技术是将一条引物或多条引物牢固地固定在固相载体上，通过调整环状核酸模板浓度将单个模板随机均匀地分散在固相载体的不同部位，并与固定在载体上的引物复性，在恒温及给定适合条件下发生扩增反应。在反应过程中，由于其中的一条链固定在固相载体中，而且是恒温扩增，双链无法发生解离，所以扩增产物也就无法移动，因此也就聚集在扩增部位。由于扩增产物不能移动，也不会出现克隆之间的产物污染。在普通的微阵列芯片中由于在一个阵列点上要固定大量的同一核酸序列的片段作为检测探针，这些核酸片段的纯度，以及在制备过程中的污染将会直接影响的该阵列点的检测质量。在美国埃菲公司用微电子光刻工艺制备的高密度的核酸微阵列芯片，由于核酸原位化学合成的产率较低，在芯片的每个阵列点上将会有较多的合成错误的核酸探针，这将在很大的程度上影响该芯片杂交的检测准确性。
通过调整扩增时间可以调整克隆分子拷贝数的多少，以及点阵中每个克隆点的大小。因为超支滚环扩增是非常高效的恒温扩增，在有引物及其它条件具备的情况下，该扩增就可以一直进行下去。对于该项技术，可以通过两种方法来调整拷贝数的大小。首先是扩增时间，扩增时间越长，拷贝数就会越高，每个克隆的直径也会越大。另一个控制克隆大小的方法就是通过改变固相载体的大小和结构的方式来控制分子克隆扩增的区域。例如，将引物固定在一个微小的区域内，当扩增进行到一定程度，因为缺少引物就无法进一步滚环扩增下去，使该克隆的大小无法进一步扩大。
该发明可以制备出高密度的单链分子克隆微阵列。由于超支滚环扩增的产物具有类似树枝状的特征，通过控制扩增的过程容易控制其扩增范围的大小。因此，每个扩增点的大小理论上可以减小到几十到几百个纳米的范围，这样就大大提高了芯片单位面积上不同分子克隆的密度。而在现在的微阵列芯片上每个阵列点一般包含有数百至数百万的核酸分子，目前每个阵列点的大小多在数微米和数百微米之间。例如，生物芯片的世界著名制造商美国埃菲公司用微电子光刻工艺制备的国际最高密度的核酸微阵列芯片，每个阵列点的直径为5微米。用普通点样法制备的微阵列芯片，其每个阵列点的直径一般大于为50微米。用微喷头制备的微阵列芯片，其每个阵列点的直径一般大于为100微米。因此，本发明在原理上可以使核酸微阵列芯片可具有巨大的核酸微阵列的点阵密度，单位面积的核酸探针密度可以提高数万倍。
该技术方案是一项恒温高效而又简单容易操作的克隆制备方法，非常适合高通量测序模板的制备。该项技术是基于超支滚环扩增发展起来的一项高通量克隆制备技术。超支滚环扩增是在恒温条件下进行的，而且扩增效率极高，在相同时间内扩增产物量是PCR扩增产物的十几倍甚至几十倍，而PCR的扩增反应需要一个温度循环过程，所以需要一个PCR仪这种特殊的装置，而超支滚环扩增是在恒温条件下进行，只要有一个恒温的条件即可。由于PCR需要变性与复性反应过程，所以固相PCR扩增中容易扩散，造成克隆之间的污染。而桥式PCR扩增条件要求非常苛刻，难以操作与控制。而本发明既发扬了固相PCR及桥式PCR的优点，又改进了其不足。因此，采用该项技术制备克隆时间短，方法简单，成本低。
本技术方案提出的方法采用了超支滚环扩增技术，该方法对于不同的核酸片段具有较好的扩增平行性，这对于全基因组测序模板的制备是十分重要的。目前，测序的DNA分子克隆的模板制备都是采用PCR技术。众所周知，PCR扩增技术对于不同序列的核酸模板其扩增效率有很大的偏差，这极大地影响被测序基因组的测序覆盖率。而本发明采用的超支滚环扩增方法，对于不同的模板序列该方法已被证明没有扩增的偏向性。
本技术方案中制备的分子克隆，能够方便地制备出相应的单链分子克隆，可用于杂交、测序等应用。因为扩增产物的一条链是固定在固相载体上，另一条链则是与固定的一条链通过互补配对形成的双链结构。另一条链可以通过变性电泳将其去除。通过变性电泳，未固定住的一条链则被去除，剩下一条单链，更加容易杂交与延伸检测。目前，有些公司，如美国454公司，采用微球与乳液PCR相结合的方法进行克隆制备，由于这项技术需要把两条引物都要进行固定，所以通过PCR反应后，微球上两条链都被固定下来，这样在延伸或杂交过程中难免会产生干扰。
本技术方案采用的固相载体既可以是整块基片，如胶膜、修饰了一些化学基团的玻片等，在整块的基片表面上可以形成不同的结构，也可以是大量的微球等可分散固相载体。本发明可以采用铺在基片上多孔网状的整块胶或者是修饰有一层化学基团的整块基片作为反应载体。采用整块胶或基片作为反应载体，制备出来的克隆随机分布在整块胶或基片上。该载体也可以是以点阵的形式分布在基片上，制备出来的克隆便可有规则的分布在阵列中的每个点上。同时我们也可以在微球体系中制备分子克隆。将不同的微球载体铺展在基底表面形成高密度的微球阵列，再进行超支滚环扩增，在每个微球上形成单一克隆，制备成克隆微阵列。
本发明中被固定的引物的5’端修饰了活性化学基团(如醛基、氨基、丙烯酰胺基团等)；在固相载体中可进行双引物、多引物或随机引物等多种形式的滚环扩增，制备出核酸分子克隆。
本发明中用于克隆模板制备的核酸为DNA、RNA或其他人工核酸如PNA、LNA等。在一个反应体系中包含有若干阵列点或微球。在每个阵列点或微球中包含有不同的核酸模板。在一次反应中同时可以制备若干不同的核酸分子克隆。本发明中在固相载体中的非固定核酸产物，可以用电泳、加热和流体冲洗等方法去除，以获得单链的核酸分子克隆。
该分子克隆的制备技术具有制备简单，扩增效率高、对于不同的DNA片断的扩增平行性好等优点。特别是该分子克隆为固定化的，经过变性电泳后，可将被固定的一条链留下来，另一条互补链去除，形成单链分子克隆，以便进行下一步的杂交或延伸实验。该技术可以在一个载体基片的不同位置制备不同的克隆，从而在一次扩增中可以制备极大量的分子克隆，实现高密度测序模板芯片的制备。这对于实现高通量、低成本人类全基因组的测序，提供了可行的模板制备技术。
四图1为整块固相载体作为反应载体进行克隆制备滚环反应后的平面示意图(A)与切面示意图(B)，其中(1)随机引物；(2)环形核酸模板；(3)正向引物；(5)滚环产物；(6)基片；(7)固相载体；(8)克隆。
图2为以阵列作为反应载体制备克隆滚环反应后的平面示意图(A)与切面示意图(B)，其中(1)随机引物；(2)环形核酸模板；(3)正向引物；(5)滚环产物；(6)基片；(7)固相载体；(8)克隆；(9)阵列。
图3为实施例3反应前(A)与反应后(B)示意图。其中(1)随机引物；(2)环形核酸模板；(3)正向引物；(5)滚环产物；(6)基片；(7)固相载体；(8)克隆；(9)阵列；(10)单链滚环产物；(12)磁珠；(13)聚丙烯酰胺凝胶。
图4为采用实施例1方案制备出来的核酸分子克隆扫描仪扫描结果图。
图5为采用实施例2方案制备出来的核酸分子克隆阵列扫描仪扫描结果图。
图6为采用实施例3方案制备出来的核酸分子克隆扫描仪扫描结果图。
五具体实施方式实施例1.采用醛基化硅片制备核酸分子克隆该方法所采用的固相载体为醛基修饰后的硅片，也就是将需要固定的引物固定在醛基硅片上，然后在硅片上进行超支滚环扩地反应，进一步制备出核酸分子克隆。
单链环形基因组扩增模板的制备基因组DNA的超声波处理选取功率适当的超声波仪，将基因组DNA随机打断成200bp-600bp大小的基因片段。
基因组DNA片段的通用连接子连接将超声波获取的随机片断纯化处理，去除一些小的和破碎的片断，然后分别采用T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow大片段DNA聚合酶I以及Taq聚合酶处理，使随机片段产生一个TA粘性末端，然后与一个通用连接子(linker15’-磷酸-GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGTCCAACT 3’linker25’-GTTGGACGTACGGCCGCCTTGGCCTCCGACT-3’)连接，形成一个双链的环，在外切酶I和外切酶III的作用下，形成单链环2。
硅片的表面醛基化修饰(A)选择大小合适的低荧光背景的硅片6，在80℃的piranha洗液(浓硫酸与30％的H2O2按体积比7∶3混合)超声洗涤2小时，然后用洗涤剂彻底清洗；用去离子蒸馏水再次彻底清洗、烘干备用；(B)硅烷化处理在上步洗涤干净的硅片置于含有2％APTES(3-Aminopro-pyltriethoxysilane)的丙酮溶液中浸泡5～10分钟，用丙酮、乙醇、去离子蒸馏水彻底清洗各两次，氮气吹干，180℃烘烤1～2小时。
(C)醛基化处理将硅烷化处理的硅片置于含5％的戊二醛(50％水溶液，Amresco)磷酸缓冲液(0.1M批H7.4)中浸泡2小时，用丙酮、乙醇、去离子蒸馏水彻底清洗各3次，氮气吹干，4℃保存备用。
(D)在硅片上固定亲和素将醛基化处理的硅片置于含亲和素蛋白质的溶液中浸泡，用去离子蒸馏水彻底清洗各3次，氮气吹干，4℃保存备用。
引物固定及单克隆测序模板的制备(A)引物固定针对上述模板设计一对引物，其中的一条与环形模板互补的引物5’端做生物素修饰3。将5’端做生物素修饰寡聚核苷酸引物用碳酸缓冲液(pH9.0)稀释到终浓度为8pmol/μL，然后将引物溶液均匀地铺于表面修饰有亲和素的硅片6，7上。将硅片置于潮湿的密封盒中室温过夜、37℃水浴2小时。然后用0.1％SDS充分清洗，去除未连接的寡聚核苷酸探针。最后用硼氢化钠(NaBH4)溶液处理30分钟后待用。
(B)在片超支滚环扩增将浓度为1pM的环形模板覆盖在上述固定有引物的硅片上，95℃变性5分钟，然后在水浴锅内慢慢降到室温。然后，无菌去离子双蒸水冲洗2遍，去除未结合的模板环。配制超支滚环扩增溶液，其溶液包含浓度没做修饰的反向引物(1μM)、Bst DNA大片段聚合酶(0.2单位/μL)、1×Bst DNA大片段聚合酶缓冲液、dNTP(800μM)，混匀后滴加到固定有模板环的硅片上，然后用硅烷处理过的盖玻片盖在溶液上，形成约5-20微米一薄层溶液。然后置于潮湿的杂交盒内，50℃条件下滚环20-24时。
(C)冲洗法去除互补自由链将固定了大量滚环扩增产物5的硅片取出后，置于0.1M的NaOH溶液中一分钟，然后用去离子冲洗5遍后，氮气吹干后，4℃保存待用。
图4为实施例1方案制备出来的核酸分子克隆，经过配对cy-3标记的探针杂交后，扫描仪扫描结果图，该图点的大小为实际结果放大十倍。其中一个点代表一个核酸分子克隆。
实施例2采用聚丙烯酰胺凝胶阵列制备核酸分子克隆聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N’甲叉双丙烯酰胺通过自由基引发聚合而成的大分子，无色透明，易观察。凝胶中的网状格子是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电渗作用比较小，不易和样品相互作用。另外，由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成不同程度交链结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，而且又有比较好的机械性质。在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。
该方法所采用的固相载体为聚丙烯酰胺凝胶。首先将玻片表面修饰一层丙烯酰胺基团，需要固定的引物5’端修饰一个丙烯酰胺基团，然后将修饰后的引物混合在丙烯酰胺溶液中，通过某种方法将凝胶溶液在修饰过的基片上形成点阵，经过丙烯酰胺凝集反应后，使凝胶牢固地固定在基片上，同时引物牢固地固定在凝胶中。然后进行超支滚环扩增，制备出核酸克隆。
单链环形基因组扩增模板的制备基因组DNA的超声波处理选取功率适当的超声波仪，将基因组DNA随机打断成200bp-600bp大小的基因片段。
基因组DNA片段的通用连接子连接将超声波获取的随机片断纯化处理，去除一些小的和破碎的片断，然后分别采用T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow大片段DNA聚合酶I以及Taq聚合酶处理，使随机片段产生一个TA粘性末端，然后与一个通用连接子(linker15’-磷酸-GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGTCCAACT 3’linker25’-GTTGGACGTACGG CCGCCTTGGCCTCCGACT-3’)连接，形成一个双链的环，在外切酶I和外切酶III的作用下，形成单链环。
基片的表面丙烯酰胺硅烷修饰基片清洗选择大小合适的低荧光背景的全反射玻片，用洗衣粉清洗玻片的表面，然后用去离子水冲洗表面。将冲洗过的玻片置于盛有去离子水的烧杯，超声清洗1-2小时。将超声洗涤后的玻片放置在含有10％NaOH溶液的封闭的容器中浸泡30分钟。最后用去离子蒸馏水再次彻底清洗、烘干备用；硅烷化处理在上步洗涤干净的载玻片置于含有10％Alfa Aesar(3-methacryloxypropyltrimethoxysilane，γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷)的丙酮溶液中浸泡1小时，用丙酮和去离子蒸馏水彻底清洗各两次，氮气吹干，烘干备用。
聚丙烯酰胺溶液制备高通量阵列及其单克隆测序模板的制备丙烯酰胺溶液制备高通量阵列及其在片超支滚环扩增配制丙烯酰胺溶液，该溶液包含丙烯酰胺(3％)、N，N’甲叉双丙烯酰胺(0.15％)、过硫酸铵(1％)、模板环(1PM)、5’端标记丙烯酰胺基团的正相引物(1μM)、30％甘油，混匀后灌注通过疏水感光胶制出的高通量阵列微孔(直径为25微米)，然后将玻片置于一湿度及TEMED浓度达到饱合的真空环境中，凝集2小时。将玻片取出后置于潮湿的杂交盒内，并将适量的滚环溶液(没做修饰的反向引物(1μM)、Bst DNA大片段聚合酶(0.2单位/μL)、1×Bst DNA大片段聚合酶缓冲液、dNTP(800μM))加在阵列9上，盖上盖玻片，50℃条件下滚环20-24小时。
电泳法去除互补自由链将固定大量滚环扩增产物5的玻片取出后，用去离子水冲洗几遍后，置于变性电泳液(0.5*TBE，42％尿素)中电泳15分钟，取出后使用洗液(Tris·HCL 10mM，PH7.5；KCL 50mM，EDTA 2mM，0.01％Triton X-100)冲洗2次，然后用去离子水冲洗2-4次，氮气吹干后，4℃保存待用。
图5为实施例2方案制备出来的核酸分子克隆阵列，经过配对cy-3标记的探针杂交后，扫描仪扫描结果图，该图点的直径为50微米。其中一个点代表一个核酸分子克隆。
实施例3采用磁珠固定与聚丙烯酰胺凝胶包埋制备核酸分子克隆该方法所采用的固相载体为表面修饰有亲合素基团的磁珠。首先将玻片表面修饰一层丙烯酰胺基团，需要固定的引物5’端修饰一个生物素基团。将修饰后的引物首先与磁珠反应，使引物牢固地固定在磁珠表面。然后将磁珠混合在丙烯酰胺溶液中，并均匀地铺在丙烯酰胺修饰过的玻片上，凝固后进行超支滚环扩增，制备出核酸克隆。
单链环形基因组扩增模板的制备基因组DNA的超声波处理选取功率适当的超声波仪，将基因组DNA随机打断成200bp-600bp大小的基因片段。
基因组DNA片段的通用连接子连接将超声波获取的随机片断纯化处理，去除一些小的和破碎的片断，然后分别采用T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow大片段DNA聚合酶I以及Taq聚合酶处理，使随机片段产生一个TA粘性末端，然后与一个通用连接子(linker15’-磷酸-GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGTCCAACT 3’linker25’-GTTGGACGTACGG CCGCCTTGGCCTCCGACT-3’)连接，形成一个双链的环，在外切酶I和外切酶III的作用下，形成单链环。
基片的表面丙烯酰胺硅烷修饰基片清洗选择大小合适的低荧光背景的全反射玻片，用洗衣粉清洗玻片的表面，然后用去离子水冲洗表面。将冲洗过的玻片置于盛有去离子水的烧杯，超声清洗1-2小时。将超声洗涤后的玻片放置在含有10％NaOH溶液的封闭的容器中浸泡30分钟。最后用去离子蒸馏水再次彻底清洗、烘干备用；硅烷化处理在上步洗涤干净的载玻片置于含有10％ Alfa Aesar(3-methacryloxypropyltrimethoxysilane，γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷)的丙酮溶液中浸泡1小时，用丙酮和去离子蒸馏水彻底清洗各两次，氮气吹干，烘干备用。
磁珠固定引物与聚丙烯酰胺凝胶包埋磁珠以及超支滚环扩增正向引物固定在磁珠表面将引物3的5’端修饰一个生物素的活性基团，然后与直径为50微米以下修饰了链霉亲合素的磁珠12结合，其反应条件为磁珠(1pM)与生物素标记的引物(1μM)在结合缓冲液(见Dynal Biotech公司磁珠产品说明书)中常温条件下作用4-6小时，并有规律地轻轻摇动。结合反应结束后，采用冲洗液(见Dynal Biotech公司磁珠产品说明书)冲洗3次，每次5分钟。固定有引物磁珠与1PM的模板环混匀，在PCR仪中加热到90℃，5分钟后关掉PCR仪，使其慢慢降到室温。然后离心去除未结合在磁珠上的模板环。
磁珠掺入丙烯酰胺溶液并铺胶配制掺有磁珠的丙烯酰胺溶液，该溶液包含磁珠(1pM)、丙烯酰胺(6％)、N，N’甲叉双丙烯酰胺(0.3％)、过硫酸铵(0.085％)、TEMED(0.085％)、没做修饰的反向引物(1μM)、Bst DNA大片段聚合酶(0.2单位/μL)、1×Bst DNA大片段聚合酶缓冲液、dNTP(800μM)，其中，TEMED最后再加到溶液中，混匀后滴加到硅烷化处理的载玻片上，然后用排斥硅烷处理过的盖玻片盖在丙烯酰胺溶液上，形成约5-20微米一薄层溶液。然后将玻片置于一湿度达到饱合的真空环境中，凝集2小时，形成凝胶13。将玻片取出后置于潮湿的杂交盒内，50℃条件下滚环20-24小时。
电泳法去除互补自由链将滚环扩增后的玻片取出后，用去离子冲洗几遍后，置于变性电泳液(0.5×TBE，42％尿素)中电泳15分钟，取出后使用洗液(Tris·HCL 10mM，PH7.5；KCL 50mM，EDTA 2mM，0.01％Triton X-100)冲洗2次，然后用去离子水冲洗2～4次，氮气吹干后，4℃保存待用。
图6为采用实施例3方案制备出来的核酸分子克隆，经过配对cy-3标记的探针杂交后，扫描仪扫描结果图，该图点的大小为实际结果放大40倍。其中一个点代表一个核酸分子克隆。
实施例4采用聚苯乙烯高分子微球固定与琼脂糖凝胶包埋制备核酸分子克隆该方法所采用的固相载体为表面修饰有氨基基团的聚苯乙烯高分子微球。首先将玻片表面清洗干净，需要固定的引物5’端修饰一个醛基基团。将修饰后的引物首先与微球反应，使引物牢固地固定在微球表面。然后将微球混合在琼脂糖溶液中，并均匀地铺在干净的玻片上，凝固后进行超支滚环扩增，制备出核酸克隆。
单链环形基因组扩增模板的制备基因组DNA的超声波处理选取功率适当的超声波仪，将基因组DNA随机打断成200bp-600bp大小的基因片段。
基因组DNA片段的通用连接子连接将超声波获取的随机片断纯化处理，去除一些小的和破碎的片断，然后分别采用T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow大片段DNA聚合酶I以及Taq聚合酶处理，使随机片段产生一个TA粘性末端，然后与一个通用连接子(linker15’-磷酸-GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGTCCAACT 3’linker25’-GTTGGACGTACGG CCGCCTTGGCCTCCGACT-3’)连接，形成一个双链的环，在外切酶I和外切酶III的作用下，形成单链环。
玻片清洗基片清洗选择大小合适的玻片，用洗衣粉清洗玻片的表面，然后用去离子水冲洗表面。将冲洗过的玻片置于盛有去离子水的烧杯，超声清洗1-2小时。将超声洗涤后的玻片放置在含有去离子水中煮沸1小时。最后用去离子蒸馏水再次彻底清洗、烘干备用。
琼脂糖包裹聚微球铺胶引物固定在塑料微球表面准备与环形通用连接子互补且5’端修饰有醛基基团的引物，以及准备表面修饰有氨基基团的微球(直径为2.5微米)。适当条件下醛基基团与氨基基团发生缩水反应，并将引物牢固地固定在微球表面。离心冲洗去除未结合上去的引物。
环形模板与引物复性结合将一定量的1pM的环形模板与等量1μM的固定有引物的微球在75℃条件下变性10分钟，然后加入与总量相等的2*杂交缓冲液，45℃条件下复性1小时，然后离心冲洗去除杂交液及未杂交上去的模板环。琼脂糖包裹微球铺胶将1pmol量载有引物与模板的微球溶解在4ml 1％的琼脂糖溶液中，混匀后，将琼脂糖均匀地铺在上述处理好的玻片上，凝固后，4℃保存待用。
随机引物1超支滚环扩增将玻片取出后置于潮湿的杂交盒内，并将适量的滚环溶液(没做修饰的随机引(每条引物浓度0.5μM)、Bst DNA大片段聚合酶(0.2单位/μL)、1×BstDNA大片段聚合酶缓冲液、dNTP(800μM))加在琼脂糖凝胶上，盖上盖玻片，50℃条件下滚环20-24小时。
电泳法去除互补自由链将滚环扩增后的玻片取出后，用去离子水冲洗几遍后，置于变性电泳液(0.5*TBE，42％尿素)中电泳15分钟，取出后使用洗液(Tris·HCL 10mM，PH7.5；KCL 50mM，EDTA 2mM，0.01％ Triton X-100)冲洗2次，然后用去离子水冲洗2-4次，氮气吹干后，4℃保存待用。
权利要求
1.一种固相制备核酸分子克隆的方法，其特征在于制备步骤为a.制备单链环形核酸模板；b.制备与上述模板相应的引物，其5’端核酸上修饰有化学基团丙烯酰胺基团、氨基、醛基或生物素；c.将步骤b所得的引物加入到有硅烷基、氨基、醛基或亲和素的固相载体中，将引物经过化学反应，连接在固相载体上；d.将步骤a所得的模板、生物酶、核酸单体、以及扩增溶液加入到经步骤c处理完毕的固相载体中；e.利用超支滚环扩增法进行扩增，形成单一的核酸分子克隆；f.互补自由链的去除。
2.根据权利要求
1所述的一种固相制备核酸分子克隆的方法，其特征在于所述的固相载体为凝胶微粒中的琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。
3.根据权利要求
1所述的一种固相制备核酸分子克隆的方法，其特征在于所述的固相载体为无机微粒中的磁珠、金属及金属氧化物或高分子固体微粒中的塑料、橡胶、尼龙。。
4.根据权利要求
1所述的一种固相制备核酸分子克隆的方法，其特征在于所述的固相载体为需要进行硅烷化、氨基化或醛基化处理的硅片和玻片。
5.根据权利要求
1所述的一种固相制备核酸分子克隆的方法，其特征在于固相载体支持物为多聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶，该支持物具有网状多孔结构。
6.根据权利要求
1所述的一种固相制备核酸分子克隆的方法，其特征在于克隆模板为DNA、RNA或人工核酸PNA、LNA。
7.根据权利要求
1所述的一种固相制备核酸分子克隆的方法，其特征在于互补自由链，即固相载体中的非固定核酸产物，可以用电泳、加热或流体冲洗方法去除。
8.根据权利要求
1所述的一种固相制备核酸分子克隆的方法，其特征在于固相载体中进行双引物、多引物或随机引物多种形式的滚环扩增，制备出核酸分子克隆。
9.根据权利要求
5所述的一种固相制备核酸分子克隆的方法，其特征在于所述固相载体支持物为阵列式，阵列中的每一个点可以制备出一个核酸分子克隆。
10.根据权利要求
9所述的一种固相制备核酸分子克隆的方法，其特征在于阵列中的每一个点包含有不同的核酸模板，在一次反应中同时可以制备不同的核酸分子克隆。
专利摘要
本发明提供了一种固相制备核酸分子克隆的方法，制备步骤为制备单链环形核酸模板；制备与上述模板相应的引物，其5’端核酸上修饰有化学基团丙烯酰胺基团、氨基、醛基或生物素；将所得的引物加入到固相载体中，将引物经过化学反应，连接在固相载体上；将所得的模板、生物酶、核酸单体、以及扩增溶液加入到经处理完毕的固相载体中；利用超支滚环扩增法进行扩增，形成单一的核酸分子克隆；互补自由链的去除。该技术具有制备简单，扩增效率高、对于不同DNA片断的扩增平行性好等优点。该技术可以在一个载体基片的不同位置制备不同的克隆，实现高密度测序模板芯片的制备。
文档编号C12Q1/68GK1995369SQ200610098379
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月14日
发明者陆祖宏, 周东蕊 申请人:东南大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan