[0051]S114.目的产物洗脱:使用Tris-HCl浓度为20mM、NaCl浓度为500mM、且PH9.0的洗脱体系进行洗脱，层析流速为20ml/min，UV280nm条件下监视采集吸收峰，获得PA-RBP复合物初体。
[0052]第一次层析纯化处理的UV280nm层析图谱和溶液电导率曲线如附图1所示。
[0053]S12.第二次层析纯化处理:将上述PA-RBP复合物初体使用固体似&?04调PH为6.0，加入固体(NH4)2SO4调整电导与平衡液相同，6000g离心lOmin，取上清备用；使用Phenyl sepharose FF/HS填料疏水柱对所述PA-RBP复合物初体进行第二次层析纯化处理，得到纯化后的PA-RBP复合物。其中，层析柱直径为1.6cm ;装填高度为Ilcm ;装填最大线性流速为300cm/H。层析步骤如下:
[0054]S121.柱平衡；采用 Na2HPO4-NaH2PO4浓度为 50mM、(NH 4) 2S04浓度为 1.5M、且 PH6.0的平衡液平衡Phenyl sepharose FF/HS填料疏水柱；
[0055]S122.样品上柱；将上述PA-RBP复合物初体上清液上柱处理；
[0056]S123.冲洗未结合血浆；使用上述平衡液对PA-RBP复合物初体样品进行洗脱，冲洗未结合的血浆；
[0057]S124.目的产物洗脱:使用 Na2HPO4-NaH2PO4浓度为 50mM、(NH4) 2S04浓度为 0.5M、且PH6.0的洗脱体系进行洗脱，层析流速为2.5ml/min,UV280nm条件下监视采集吸收峰，获得纯化后的PA-RBP复合物。
[0058]第二次层析纯化处理的UV280nm层析图谱和溶液电导率曲线如附图2所示。
[0059]S13.PA-RBP复合物的解离:将所述纯化后的PA-RBP复合物加入固体(NH4)別4调整电导率与平衡液相同，加入固体尿素进行解离处理，使得尿素的终浓度为5M，处理过夜，得到含有PA和RBP的混合样品。
[0060]S14.第三次层析纯化处理:使用Phenyl sepharose FF/HS填料疏水柱对所述含有PA和RBP的混合样品进行第三次层析纯化处理，分离得到PA和RBP。其中，层析柱直径为1.6cm ;装填高度为Ilcm ;装填最大线性流速为300cm/H。层析步骤如下:
[0061]S141.柱平衡；采用 Na2HPO4-NaH2PO4浓度为 50mM、(NH4)2SO4浓度为 1.5M、且 PH6.0的平衡液平衡Phenyl sepharose FF/HS填料疏水柱；
[0062]S142.样品上柱；将上述含有PA和RBP的混合样品上柱处理；
[0063]S143.冲洗未结合血浆；使用上述平衡液对上述含有PA和RBP的混合样品进行洗脱，冲洗未结合的血浆；
[0064]S144.目的产物洗脱:分别先后采用下述洗脱液A和洗脱液B作为洗脱体系，
[0065]洗脱液A !Na2HPO4-NaH2PO4浓度为 50mM、(NH 4) 2S04浓度为 0.5M、且 PH6.0 ；
[0066]洗脱液B !Na2HPO4-NaH2PO4浓度为 50mM、且 PH6.0 ;层析流速为 2.5ml/min，UV280nm条件下监视采集吸收峰，获得PA和RBP单体。
[0067]第三次层析纯化处理的UV280nm层析图谱和溶液电导率曲线如附图3所示。
[0068]图4是本发明实施例所述方法中各步纯化样品的SDS-PAGE蛋白电泳检测图谱，其中M为蛋白质分子量标准(100KD、70KD、55KD、35KD、25KD、15KD) ;1代表人血浆；2代表UNOsphere Q离子交换层析柱流穿样品；3/4代表UNOsphere Q离子交换层析先后获得的洗脱峰样品；5代表使用疏水层析柱进行第二次层析纯化处理获得的纯化后的PA-RBP复合物；6代表使用疏水层析柱进行第三次层析纯化处理，得到的PA样品(洗脱峰A) ;7代表使用疏水层析柱进行第三次层析纯化处理，得到的RBP样品(洗脱峰B)。
[0069]说明:本发明中，所述表示浓度的M表示mol/L，mM表示mmol/L ;
[0070]所述UNOsphere Q、所述 UNOsphere Q (B1-rad)和所述 sepharose FF/HS，均表不色谱填料的型号。
[0071]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法，包括下述步骤: 取血浆，使用阴离子交换柱对其进行第一次层析纯化处理，获得PA-RBP复合物初体； 使用疏水柱对所述PA-RBP复合物初体进行第二次层析纯化处理，得到纯化后的PA-RBP复合物； 将所述纯化后的PA-RBP复合物进行解离处理，得到含有PA和RBP的混合样品； 使用疏水柱对将所述混合样品进行第三次层析纯化处理，分离得到PA和RBP。
2.如权利要求1所述的从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法，其特征在于，将所述纯化后的PA-RBP复合物进行解离处理的方法为:在所述纯化后的PA-RBP复合物中加入尿素，使得所述尿素的终浓度为4-6mol/L。
3.如权利要求1所述的从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法，其特征在于，在使用离子交换层析柱对血浆进行第一次层析纯化处理的步骤中，所述阴离子交换柱的填料和所述样品的体积比为1: (1-1.2)。
4.如权利要求1所述的从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法，其特征在于，使用阴离子交换柱对其进行第一次层析纯化处理的步骤中，所述阴离子交换柱采用UNOsphere Q填料的阴离子交换层析柱。
5.如权利要求1、4任一所述的从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法，其特征在于，在使用离子交换层析柱对血浆进行第一次层析纯化处理的步骤中，所述第一次层析纯化处理的洗脱体系采用Tris-HCl浓度为20mM、NaCl浓度为500mM、且PH9.0的洗脱液。
6.如权利要求1所述的从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法，其特征在于，在使用疏水柱对所述PA-RBP复合物初体进行第二次层析纯化处理的步骤中，所述疏水柱采用Phenyl sepharose FF/HS填料的疏水层析柱。
7.如权利要求1、6任一所述的从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法，其特征在于，在使用疏水柱对所述PA-RBP复合物初体进行第二次层析纯化处理的步骤中，所述第二次层析纯化处理的洗脱体系采用Na2HPO4-NaH2PO4浓度为50mM、(NH4)2SO4浓度为0.5M、且PH6.0的洗脱液。
8.如权利要求1所述的从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法，其特征在于，在使用疏水柱对将所述混合样品进行第三次层析纯化处理的步骤中，所述疏水柱采用Phenyl sepharose FF/HS填料的疏水层析柱。
9.如权利要求1、8任一所述的从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法，其特征在于，在使用疏水柱对将所述混合样品进行第三次层析纯化处理的步骤中，所述第三次层析纯化处理分别先后采用下述洗脱液A和洗脱液B作为洗脱体系，洗脱液 A !Na2HPO4-NaH2PO4浓度为 50mM、(NH 4)2S04浓度为 0.5M、且 PH6.0 ；洗脱液 B !Na2HPO4-NaH2PO4浓度为 50mM、且 PH6.0。
10.如权利要求1所述的从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法，其特征在于，所述第二次层析纯化处理、所述第三次层析纯化处理的层析流速为1.5-3ml/min。
【专利摘要】本发明适用于蛋白纯化技术领域，提供了一种从血浆中纯化前白蛋白和视黄醇结合蛋白的方法。该方法包括下述步骤：取血浆，使用阴离子交换柱对其进行第一次层析纯化处理，获得PA-RBP复合物初体；使用疏水柱对所述PA-RBP复合物初体进行第二次层析纯化处理，得到纯化后的PA-RBP复合物；将所述纯化后的PA-RBP复合物进行解离处理，得到含有PA和RBP的混合样品；使用疏水柱对将所述混合样品进行第三次层析纯化处理，分离得到PA和RBP。
【IPC分类】C07K1-18, C07K14-47, C07K1-20, C07K14-765
【公开号】CN104558155
【申请号】CN201510019329
【发明人】李光飞, 陶玲, 徐敏, 苏少博
【申请人】山西瑞亚力科技有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月14日