一种利用浒苔多糖制备富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用浒苔多糖制备富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖的方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]浒苔多糖是一种由鼠李糖、木糖、葡萄糖醛酸组成并富含硫酸基的聚阴离子糖链。Tang et al.(2013)研究发现浒苔多糖的单糖组成为鼠李糖、木糖、葡萄糖醛酸，质量百分比分别为64.2%、18.2%、12.6%，硫酸基含量为19.6%,多糖分子量为103.51 KDa0 Ray etal.(2006)研究表明浒苔中鼠李糖为(I — 2,4)键连接，葡萄糖醛酸为(I — 4)键连接，木糖为(I — 4)键连接，硫酸基处于鼠李糖C-3端形成鼠李糖硫酸酯。
[0003]研究发现浒苔多糖具有抗肿瘤、抗凝血、降血糖血脂、提高免疫力、抗氧活性等功效。浒苔多糖含有两种潜在功能糖成分:葡萄糖醛酸、鼠李糖硫酸酯。其中，葡萄糖醛酸有护肝解毒作用，是功能饮料、食品、化妆品的主要添加剂。而鼠李糖可参与合成香料、强心苷类药物和外源凝集素等，具有明显的免疫活性。与鼠李糖硫酸酯结构相似的岩藻糖硫酸酯被证实具有神经传导、免疫调节等重要生理功能，因此鼠李糖硫酸酯是一种潜在的功能成分。
[0004]然而，在应用过程中，多糖较高的分子量和粘度降低了其生理功能。寻找一种专一性制备寡糖的方法成为解决其应用的有效手段。相比于化学法和物理法，微生物酶法有其潜在优势:(1)反应高效、稳定，产物聚合度可控的优势；(2)产物均一度好、收率高，易于分离、纯化；(3)条件温和，具有环境友好性，产物较好保留了糖链的活性基团。
[0005]然而，目前国内外尚未发现有关利用浒苔多糖通过微生物酶制备富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖的研究报道。
【发明内容】
[0006]本发明提供一种利用浒苔多糖裂解酶制备富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖的方法。该方法以浒苔多糖为原料，在微生物酶的作用下被专一性降解，进而获得富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖。本发明方法具有专一性好、条件温和、产量高、寡糖活性基团完整、成本低等优点。对新型活性寡糖的开发、构效关系及应用开发都具有重要的现实意义。
[0007]本发明涉及的产將苔多糖裂解酶的菌株为feiefloraJw? sp.LP214,该菌株已于2014年4月20日保藏在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2014136o
[0008]本发明提供的技术方法是采用如下步骤实现富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖的制备:
(I)将Catenovulmi sp.LP214菌株接种到产酶培养基中进行发酵，其中产酶培养基组成为浒苔多糖10 g、酵母膏3 g，硫酸镁4 g，氯化钙0.5 g，氯化钠20 g，硫酸铵1.5 g，磷酸高铁0.2 g，自来水1000 ml, pH 7.5 ;发酵条件为32°C、36 h ;将发酵液10000 r/min离心5min,得上清液。
[0009](2)将步骤(I)中的上清液于40°C保温30-45 min后取出冷却至室温得浒苔多糖裂解酶。
[0010](3)浒苔多糖溶于水制备0.1-2.5% (w/v)的浒苔多糖溶液，将步骤(2)获得的浒苔多糖裂解酶按8-16 U/g (浒苔多糖)加入至浒苔多糖溶液中，于25-45°C，pH 5.0-7.5，酶解1-8 h ;其中I个酶活力单位定义为35°C条件下，每分钟产生I ymol还原糖(以葡萄糖计)所需要的酶量。酶解完毕后，升温至100°c,保温1-2 min使酶灭活,冷却后,8000 r/min离心10 min，取上清酶解液；将上清酶解液用截留分子量为3000 Da的超滤膜除去大分子物质，得到富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖。
[0011]本发明方法制备的富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖通过以下具体方法进行定量定性分析:
(I)将上述制备的富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖经水解后，采用高效液相色谱法测定寡糖的单糖组成。以购买Sigma公司的甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖作为标准品，检测寡糖的单糖组成(如图1、图2)。酶解产物分析结果表明，该类寡糖的单糖组成主要为鼠李糖、葡萄糖醛酸、木糖，其中鼠李糖含量> 30%。
[0012](2)将上述制备的富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖采用氯化钡比浊法进行硫酸基含量测定，寡糖硫酸基含量> 15%。
[0013](3)将上述制备的富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖进行ES1-MS (负离子)分析，结果见图3。其中丰度较高的片段有7种，分子量分别为402、628、760，982，1124，1268，1430，聚合度分别为2-8。根据寡糖的单糖组成和取代基分析结果，例如，402 Da的寡糖是由一个鼠李糖硫酸酯和一个葡萄糖醛酸组成的二糖。其它寡糖片段中分别含有2-4个不等的鼠李糖硫酸酯单元。
【附图说明】
[0014]图1为单糖标准品的液相色谱图，其中出峰时间为21.668、25.986、27.971、29.957,31.077,32.949,34.884,35.469,36.126 min 分别为甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、
半乳糖醛酸、内标乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖。
[0015]图2为水解后富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖的液相色谱图，在25.986、27.971、35.469 min分别出现吸收峰表明水解后富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖中含有鼠李糖、葡萄糖醛酸、木糖。
[0016]图3为富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖的质谱图。
【具体实施方式】
[0017]实施例1
富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖的制备方法，包括以下步骤:
CatenovuIum sp.LP214菌株接种到产酶培养基中进行发酵，其中产酶培养基组成为浒苔多糖10 g、酵母膏3 g，硫酸镁4 g，氯化钙0.5 g，氯化钠20 g，硫酸铵1.5 g，磷酸高铁0.2 g，自来水1000 ml, pH 7.5 ;发酵条件为32°C、36 h ;将发酵液10000 r/min离心5min,得上清液。
[0018](2)将步骤(I)中的上清液于40°C保温30-45 min后取出冷却至室温得浒苔多糖裂解酶。
[0019](3)将I Kg浒苔多糖溶于100 L蒸馏水中，调pH为6-7。向浒苔多糖溶液中加入10个单位的由步骤(2)制备的浒苔多糖裂解酶进行酶解，I个酶活力单位定义为35°C条件下，每分钟产生I μ mo I还原糖(以葡萄糖计)所需要的酶量；具体方法为于30°C, 100 r/min震荡反应5 h ;酶解完毕后，升温至100°C，保温1-2 min使酶灭活，冷却后，8000 r/min离心10min，取上清酶解液；将上清酶解液用截留分子量为3000 Da的超滤膜除去大分子的物质，得到富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖。
[0020]实施例2
富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖的制备方法，包括以下步骤:
CatenovuIum sp.LP214菌株接种到产酶培养基中进行发酵，其中产酶培养基组成为浒苔多糖10 g、酵母膏3 g，硫酸镁4 g，氯化钙0.5 g，氯化钠20 g，硫酸铵1.5 g，磷酸高铁0.2 g，自来水1000 ml, pH 7.5 ;发酵条件为32°C、36 h ;将发酵液10000 r/min离心5min,得上清液。
[0021](2)将步骤(I)中的上清液于40°C保温30-45 min后取出冷却至室温得浒苔多糖裂解酶。
[0022](3)将2 Kg浒苔多糖溶于100 L蒸馏水中，调pH为6_7。向浒苔多糖溶液中加入10个单位的由步骤(2)制备的浒苔多糖裂解酶进行酶解，I个酶活力单位定义为35°C条件下，每分钟产生I μ mo I还原糖(以葡萄糖计)所需要的酶量；具体方法为于35°C, 100 r/min震荡反应5 h ;酶解完毕后，升温至100°C，保温1-2 min使酶灭活，冷却后，8000 r/min离心10 min，取上清酶解液；将上清酶解液用截留分子量为3000 Da的超滤膜除去大分子物质，得到富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖。
【主权项】
1.产浒苔多糖裂解酶的菌株，该菌株是Gatenovulumsp.LP214，保藏号CCTCC NO:M2014136，保藏单位:中国典型型培养物保藏中心。
2.一种利用浒苔多糖裂解酶制备富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖的方法，步骤如下: (1)浒苔多糖裂解酶的获得 将权利要求1所述的菌株接种到产酶培养基中进行发酵，发酵条件为32°C、36 h ;其中产酶培养基组成为浒苔多糖10 g、酵母膏3 g，硫酸镁4 g，氯化钙0.5 g，氯化钠20 g，硫酸铵1.5 g，磷酸高铁0.2 g,自来水1000 ml, pH 7.5 ;将发酵液10000 r/min离心5 min,得上清液，将上清液于40°C保温30-45 min后取出冷却至室温得浒苔多糖裂解酶； (2)富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖的制备 将浒苔多糖溶于水制备0.1-2.5% (w/v)浒苔多糖溶液，将步骤(I)获得的浒苔多糖裂解酶加入浒苔多糖溶液中，于25-45°C，pH 5.0-7.5，酶解1_8 h ;酶解完毕后，升温至100°C，保温1-2 min使酶灭活，冷却后，8000 r/min离心10 min,取上清酶解液；将上清酶解液用截留分子量为3000 Da的超滤膜除去大分子物质，得到富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖。
3.根据权利要求2的方法，其中所述的富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖，聚合度为2-8，分子量含有402、628、760 Da,鼠李糖硫酸酯的含量> 30%。
【专利摘要】本发明涉及一种利用浒苔多糖制备富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖的方法，属于生物技术领域。本发明利用菌株<i>Catenovulum</i><i></i>sp.LP214进行浒苔多糖裂解酶的发酵制备，利用该酶降解浒苔多糖制备富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖，条件为25-45℃，pH5-7.5，酶解时间1-8h。该富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖的聚合度为2-8，其中鼠李糖硫酸酯的含量≥30%。制备方法具有操作简单、条件温和、产量高、单糖结构完整、成本低等优点，易于工业化生产。CCTCC NO：M201413620140420
【IPC分类】C12P19-14, C12R1-01, C12N1-20
【公开号】CN104560774
【申请号】CN201410298678
【发明人】王鹏, 李银平
【申请人】中国海洋大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年6月30日