养基：可溶性淀粉 20g，KN03 20g，K2HP03 0? 5g，MgS04 0? 5g，FeS04 0? Olg， 水1000ml，pH 7. 2-7. 4,加琼脂20g成固体培养基，配置时，先用少量冷水，将淀粉调成糊 状，导入煮沸的水中，在火中加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补水至l〇〇〇ml ; 4) 马丁氏培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KHP03 lg，MgS0(7H20) 0. 5g，1%孟加拉红水溶 液，3. 3ml，水1000ml，pH自然，加琼脂15g成固体培养基，临用前加入0. 03%链霉素稀释液 100ml，使每ml培养基含链霉素30呢； (3) 菌种的富集： 将垃圾堆肥样品称取l〇g置于无菌锥形瓶中，加入l〇〇mL无菌水振荡均匀后，取10mL 悬浮液于盛有100mL富集培养基的锥形瓶中，在28°C，220r/min下振荡培养3d，即为复合 微生物菌群； (4) 耐旱复合微生物菌群的强化： 混合微生物菌群耐旱强化采用的是逐步增加PEG6000浓度的方法进行，在强化过程 中，视〇D_增长而逐步提高PEG6000浓度，PEG6000的浓度以50 g/L的梯度增加，最终目 标是 250 g/L ; PEG6000 的浓度分别为（w/w) 5%、10%、15%、20% 和 25%，每增加一次 PEG6000 的浓度，要待菌体增长量稳定后，继续增加PEG6000的浓度，逐级强化出耐旱混合微生物菌 群； (5) 强化复合微生物的分离及纯化： 1)倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏I号琼脂培养基、马丁氏（PDA)琼脂培 养基高温灭菌，冷却至55~60°C时，在马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液，终质量浓度为 30l^g/ml，混均匀后分别倒平板； 2) 制备混合微生物稀释液：用移液枪吸取lml强化后的混合微生物菌悬液加入盛有 9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为KT1稀释液，以此类推制成（呢/ml) 10'10'KT4、 1(T5和KTVg/ml几种浓度的稀释液； 3) 涂布：用移液枪分别吸取0. 2ml不同浓度的稀释菌悬液准确放入相应培养基平板中 央，每个不同浓度梯度处理重复3次，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀； 4) 培养：牛肉膏蛋白胨平板倒置于37°C培养箱中培养，将含高氏I号培养基和马丁氏 培养基（PDA)的平板倒置于28°C培养箱中培养； (6)平板划线分离法 挑菌落：将培养后长出的单个菌落分别挑取少许菌苔在新的上述3种培养基上进行划 线纯化，直到培养基上长出来的是纯培养，如不纯，仍需重复该步骤，最后对强化的复合微 生物进行鉴定；经过多次划线纯化得到强化复合微生物菌群。其中得到强化复合微生物菌 群指的是：蜡状芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌和粘红酵母。
[0009] 本发明进一步公开采用此方法制备的强化复合微生物菌群在提高中度和重度干 旱胁迫下草坪草抗旱能力方面的应用；特别是在中度和重度干旱胁迫下高羊茅保护酶活 性、在降低中度和重度干旱胁迫下高羊茅叶片丙二醛和脯氨酸含量方面的应用；其中所述 的强化复合微生物菌群指的是蜡样芽孢杆菌，赖氨酸芽孢杆菌和粘红酵母按重量份数比为 1:1:1的比例进行配置。
[0010] 本发明更加详细的制备方法如下： 1研制材料与方法 1.1材料： 生活垃圾堆肥取自天津市小淀垃圾堆肥厂。堆肥的pH为7. 62,有机质含量12. 12 %， 全氮量5. 18 %，有效磷含量77. 92 mg ? kg'全钾50. 83 g ? kg'容重0. 85 g ? I71，饱和含 水量 66. 58 g ? mL i。
[0011] 1. 2培养基 富集培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.4-7.6，加15§琼脂成固 体培养基； 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7. 0-7. 2,加15g 琼脂成固体培养基； 高氏 I 号培养基：可溶性淀粉 20g，KN03 20g，K2HP03 0? 5g，MgS04 0? 5g，FeS04 0? Olg，水 1000ml，pH 7. 2-7. 4,加琼脂20g成固体培养基(配置时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状， 导入煮沸的水中，在火中加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补水至l〇〇〇ml); 马丁氏培养基：葡萄糖l〇g，蛋白胨5g，KHP03 lg，MgS0(7H20) 0. 5g，l%孟加拉红水溶 液，3. 3ml，水1000ml，pH自然，加琼脂15g成固体培养基(临用前加入0. 03%链霉素稀释液 100ml，使每ml培养基含链霉素30呢）。
[0012] 1.3菌种的富集 将堆肥样品称取l〇g置于无菌锥形瓶中，加入lOOmL无菌水振荡均勾后，取10mL悬浮 液于盛有100mL富集培养基的锥形瓶中，在28°C，220r/min下振荡培养3d，即为混合微生 物菌群。
[0013] 1.4微生物的强化 混合微生物菌群耐旱强化采用的是逐步增加PEG6000浓度的方法。未经过强化的混合 菌群一般在无PEG6000的条件下生长较好，在强化过程中，视00_增长而逐步提高PEG6000 浓度，PEG6000的浓度以50 g/L的梯度增加，最终目标是250 g/L ;即在本实验中PEG6000 的浓度分别为（w/w) 5%、10%、15%、20%和25%。每增加一次PEG6000的浓度，要待菌体增长 量稳定后，才能继续增加PEG6000的浓度，逐级强化出耐旱混合微生物菌群。
[0014] 1. 5强化微生物的分离及纯化 1. 5. 1稀释涂布平板法 1)倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏I号琼脂培养基、马丁氏（PDA)琼脂培 养基高温灭菌，冷却至55~60°C时，在马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液(终质量浓度为 30l^g/ml )，混均匀后分别倒平板。
[0015] 2)制备混合微生物稀释液：用移液枪吸取1ml强化后的混合微生物菌悬液加入盛 有9ml无菌水的大试管中充分混勾，此为KT 1稀释液，以此类推制成10'10'10'101口 1〇_6几种浓度的稀释液。
[0016] 3)涂布：用移液枪分别吸取0. 2ml不同浓度的稀释菌悬液准确放入相应培养基平 板中央，每个不同浓度梯度处理重复3次。用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。
[0017] 4)培养：牛肉膏蛋白胨平板倒置于37°C培养箱中培养，将含高氏I号培养基和马 丁氏培养基（PDA)的平板倒置于28°C培养箱中培养。
[0018] 1. 5. 2平板划线分离法 挑菌落：将培养后长出的单个菌落分别挑取少许菌苔在新的上述3种培养基上进行划 线纯化。直到培养基上长出来的是纯培养，如不纯，仍需重复该步骤。
[0019] 1.6强化微生物的鉴定 按照Ezup柱式试剂盒的操作手册提取优势菌种的DNA。优势细菌的PCR体系： 10 X Buffer (with MgCl2)2 dNTP (10mmol/L)0. 4m, 341f (10Mmol/L)mL, 534r (lOMmol/ L) 1ML，Taq酶（5u/ML) 0. 4ML，模板DNA 1ML，加超纯水定容至终体积20ML。PCR反应条件： 94°C 5min 预变性，94°C变性 lmin，55°C复性 45s，72°C延伸 45s，30 个循环，72°C延伸 lOmin。 引物为 341f (5' -CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3')和 534r (5' -AIT ACC GCG GCT GCT GG-3')。优势真菌的 PCR 反应体系：l〇XBuffer (without MgCl2)2 ML，MgCl2 (25mmol/L)1.6ML，dNTP (lOmmol/L) 0? 4ML，Geoll (10Mmol/L)0. 4ML，GeoA2 (10Mmol/L)0. 4ML，Taq 酶（5u/ML)0. 2ML，模板 DNA 1ML，加超纯水定容至终体积20ML。PCR反应条件：94°C 4min预变性，94°C变性lmin，54°C复 性 lmin，72°C延伸 2min，30 个循环，72°C延伸 7min。引物为 GeoA2 (5' -CCA GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3，）和 Geoll