(5' -ACC TTG TTA CTT TTA CTT CC-3'）。将得到的 PCR 产物送到北京华大基因测序部，根据测序的结果，在BLAST系统中找出对应菌种。
[0020] 2研制结果分析 2. 1强化耐旱微生物曲线的测定 对在各PEG6000浓度的培养基中培养的菌群，分别在刚转接时测其0D值，即为菌体的 0D初值。以后每隔一定时间（PEG6000浓度在15%以下的菌种间隔8小时，20%和25%PEG6000 浓度下的菌种间隔24小时）测一次菌体的0D值，绘制0D-时间曲线图。
[0021] (1)直接升高PEG6000浓度下微生物菌群生长曲线 由图1可见，在无PEG6000的浓度下，菌群的适应期很短，很快就达到对数生长期，最大 生长值也是最高的。随着PEG6000的浓度升高，菌群的适应期逐渐增加，达到最大生长值所 需的时间也相应增长，最大生长值也随之降低。在高PEG6000浓度下，菌群需要一个相对 较长的适应期才能达到对数生长期，达到最大生长值的时间也最长，而且最大生长值也为 最低。
[0022] 结果说明，堆肥中的混合菌群随着PEG6000浓度的升高生长状况逐渐变差(适应 期增长)，达到最大生长值的时间也相应延长，最大生长值也随之降低。这是因为初始接种 菌群的PEG6000浓度很低，随着PEG6000浓度的升高，菌体要承受PEG6000浓度带来的压 力，需要一个适应过程。由于菌体的生长是一个缓慢的过程，而PEG6000浓度的升高是一个 剧变的过程，菌群对PEG6000浓度的变化是逐渐适应的。随着PEG6000浓度的升高，大量不 能适应的个体会死亡，此时会出现一个适应期，能适应高PEG6000浓度的菌群将会生存下 来，并继续大量繁殖，所以在适应期后会出现对数生长期。
[0023] (2)逐步提高PEG6000浓度下微生物菌群生长曲线 从图2中可以看出，经过上述低PEG6000浓度下强化的菌群进行转接后，适应期会缩短 (与未经过强化的相比)，很快就进入到对数生长期，达到最大生长值所需要的时间也缩短 了，而且最大生长值也有所提高。
[0024] 经过逐步提高PEG6000浓度的方法强化的混合菌群，已经适应了前一个相对较高 PEG6000浓度的环境。而且由于转接是在菌群的对数生长期进行的，且转接后新培养基的营 养丰富，菌群的生长稳定、迅速，与直接升高PEG6000浓度的方法相比，适应期也相应缩短， 很快就进入对数生长期，达到最大生长值的时间也大大缩短了。此外，经过逐步强化的混合 菌群在高PEG6000浓度下的生长最大值也有所提高。
[0025] 2. 2强化耐旱微生物分离及纯化结果 本次实验对堆肥中的微生物进行耐旱强化，最终经过多次划线纯化得到的3种纯种微 生物，为2种细菌和1种真菌，结果如图2所示。
[0026] 依据培养特征和菌体形态进行初步鉴定，可以将得到的2种细菌，归为芽孢杆菌， 而真菌为酵母菌.详细的微生物菌落形态见表1 :
【主权项】
1. 一种垃圾堆肥中草坪耐旱强化复合微生物菌群的制备方法，其特征在于按如下的步 骤进行： (1) 材料：生活垃圾堆肥取自天津市小淀垃圾堆肥厂，垃圾堆肥的pH为7. 62,有机质 含量12. 12 %，全氮量5. 18 %，有效磷含量77. 92mg?kg'全钾50. 83g?kg'容重0. 85 g?L'饱和含水量 66. 58g?mL-1; (2) 培养基： 1) 富集培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，水1000ml，pH7. 4-7. 6,加15g琼脂 成固体培养基； 2) 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，水1000ml，pH7. 0-7. 2,加 15g琼脂成固体培养基； 3) 高氏I号培养基：可溶性淀粉 20g，KN03 20g，K2HP03 0? 5g，MgS04 0? 5g，FeS04 0?Olg， 水1000ml，pH7. 2-7. 4,加琼脂20g成固体培养基，配置时，先用少量冷水，将淀粉调成糊 状，导入煮沸的水中，在火中加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补水至1000 ml; 4) 马丁氏培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KHP03lg，MgS0(7H20) 0. 5g，1%孟加拉红水溶 液，3. 3ml，水1000ml，pH自然，加琼脂15g成固体培养基，临用前加入0. 03%链霉素稀释液 100ml，使每ml培养基含链霉素30呢； (3) 菌种的富集： 将垃圾堆肥样品称取IOg置于无菌锥形瓶中，加入IOOmL无菌水振荡均匀后，取IOmL悬浮液于盛有IOOmL富集培养基的锥形瓶中，在28°C，220r/min下振荡培养3d，即为复合 微生物菌群； (4) 耐旱复合微生物菌群的强化： 混合微生物菌群耐旱强化采用的是逐步增加PEG6000浓度的方法进行，在强化过程 中，视〇D_增长而逐步提高PEG6000浓度，PEG6000的浓度以50g/L的梯度增加，最终目 标是 250g/L;PEG6000 的浓度分别为（w/w) 5%、10%、15%、20% 和 25%，每增加一次PEG6000 的浓度，要待菌体增长量稳定后，继续增加PEG6000的浓度，逐级强化出耐旱混合微生物菌 群； (5) 强化复合微生物的分离及纯化： 1) 倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏I号琼脂培养基、马丁氏（PDA)琼脂培 养基高温灭菌，冷却至55-60°C时，在马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液，终质量浓度为 30l^g/ml，混均匀后分别倒平板； 2) 制备混合微生物稀释液：用移液枪吸取Iml强化后的混合微生物菌悬液加入盛有 9ml无菌水的大试管中充分混勾，此为KT1稀释液，以此类推制成10'10'10'101口 KTVg/ml几种浓度的稀释液； 3) 涂布：用移液枪分别吸取0. 2ml不同浓度的稀释菌悬液准确放入相应培养基平板中 央，每个不同浓度梯度处理重复3次，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀； 4) 培养：牛肉膏蛋白胨平板倒置于37°C培养箱中培养，将含高氏I号培养基和马丁氏 培养基（PDA)的平板倒置于28°C培养箱中培养； (6) 平板划线分离法 挑菌落：将培养后长出的单个菌落分别挑取少许菌苔在新的上述3种培养基上进行划 线纯化，直到培养基上长出来的是纯培养，如不纯，仍需重复该步骤，最后对强化的复合微 生物进行鉴定；经过多次划线纯化得到强化复合微生物菌群。
2. 权利要求1所述垃圾堆肥中耐旱强化复合微生物菌群的制备方法，其中得到强化复 合微生物菌群指的是：蜡状芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌和粘红酵母。
3. 采用权利要求1所述方法制备的强化复合微生物菌群在提高中度和重度干旱胁迫 下草坪草抗旱能力方面的应用；其中所述的强化复合微生物菌群指的是蜡样芽孢杆菌，赖 氨酸芽孢杆菌和粘红酵母按重量份数比为1:1:1的比例进行配置。
4. 采用权利要求1所述方法制备的强化复合微生物菌群在提高中度和重度干旱胁迫 下高羊茅保护酶活性方面的应用；其中所述的强化复合微生物菌群指的是蜡样芽孢杆菌， 赖氨酸芽孢杆菌和粘红酵母按重量份数比为1:1:1的比例进行配置。
5. 采用权利要求1所述方法制备的强化复合微生物菌群在降低中度和重度干旱胁迫 下高羊茅叶片丙二醛和脯氨酸含量方面的应用；其中所述的强化复合微生物菌群指的是蜡 样芽孢杆菌，赖氨酸芽孢杆菌和粘红酵母按重量份数比为1:1:1的比例进行配置。
【专利摘要】本发明公开了一种垃圾堆肥中草坪耐旱强化复合微生物菌群的制备方法及应用。其中耐旱微生物菌株的获得采用的是PEG6000模拟干旱胁迫来强化堆肥中的微生物。强化复合微生物菌群指的是蜡样芽孢杆菌，赖氨酸芽孢杆菌和粘红酵母按重量份数比为1:1:1的比例进行配置。本发明旨在获得强化堆肥微生物，并为强化城市生活垃圾堆肥微生物菌剂的草坪耐旱应用提供技术支撑。
【IPC分类】C12R1-645, C12R1-085, C12N1-20, A01P21-00, C12R1-07, A01N63-04, C12N1-16
【公开号】CN104762233
【申请号】CN201510141114
【发明人】多立安, 赵树兰, 高星星
【申请人】天津师范大学
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年3月30日