采用Taqman探针法鉴定小麦黑穗菌(Tilletia controversa Kühn)的方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物病害检测技术，特别是一种采用化qman探针法鉴定小麦黑穗菌 (TilletiacontroversaKilhn)的方法。
【背景技术】
[0002] 小麦矮腥黑穗病菌（Tilletiacontroversa肺hn，简称TCK)引起的小麦矮腥黑 穗病是一种重要的国际检疫性病害，对小麦生产造成严重的危害，也是我国外来生物入侵 研究的主要物种之一（王圆，1997)。在其流行年份，小麦矮腥黑穗病引起的产量损失一般 为20 %~50 %，严重时可达75 %~90 %，甚至绝产。病菌抗逆性极强，其冬抱子在±中可 存活3~7年，包裹在菌瘦中的冬抱子甚至可保持活力长达10年W上。此病害一旦发生， 很难防治或根除，所W国际上有15个国家将其列为检疫对象。我国在20世纪60年代把此 病害列为检疫对象。在腥黑粉菌中，TCK与其近缘种小麦网腥黑粉菌、小麦光腥黑粉菌等在 形态学上极为相似，难于区别。
[0003] 传统的病害诊断、检测方法主要是依据病原形态学、生理学和生物化学的特性，不 但过程繁琐、时间周期长，而且准确性差、精度不高。因此，利用分子生物学手段快速、准确 地鉴别小麦矮腥黑粉菌具有重要的意义。
[0004] 1996年化rreira等首次将PCR技术引进到印度腥黑穗病的鉴定中来，他们选择 了印腥线粒体DNA的一个2. 3化的EcoRl片段进行了克隆和测序，设计的特异性引物TI1/ TI4从25种腥黑穗病菌菌株中鉴定出了印腥。另外，Smith等通过克隆印腥线粒体DNA的 化al片段，进行了序列分析，设计了两套寡核巧酸引物对T117/M1和T117/M2能分别从印 腥中扩增出大小为825bp和118bp特异性片段，也实现了对印度腥黑穗病的检测鉴定工作。 2000年化ederick根据线粒体的差异设计了 5对针对印度腥黑穗病的特异性引物和3对针 对黑麦草腥黑穗病的特异性引物，分别能将印度腥黑穗病菌株和黑麦草腥黑穗病菌株从其 近缘属种中鉴别出来。张竞宇等利用核糖体ITS序列上的差异在Tilletia属20个种中设 计了一对特异性引物T1/T2,能将T.indica和T.walkeri从其它种中区分开来，而后又根 据T.indica和T.wa化eri线粒体之间的差异设计了一对特异性引物M1/M2,可W将二者区 分开来，为了使反应更为灵敏，建立了套式PCR技术，W便于提供更简单的鉴定方法。2004 年高强利用RATO技术找到了一条可W将小麦网腥黑穗病菌株和小麦矮腥黑穗病菌株区别 于其它黑粉菌株的条带，但是很遗憾在矮腥黑粉菌和网腥黑粉菌之间没有找到有差异的条 带，没能将二者分开。梁宏等人依据核糖体的IGS1区特性，设计了一对特异性引物，可W将 小麦光腥黑穗病菌株从其近缘属种中鉴别出来。
[0005] 发明人前期研究中获得TCK差异片段66化p(SeqIDNo. 1)，并根据所得差异片段 获得TCKScar标记及引物，见专利号201110051404.X记载。该标记能用于常规PC鉴定 TCK菌，能够特异性地将TCK从近似菌种中鉴定出来。但是发明人发现，该专利中的标记引 物及PCR方法不能很好地应用于预警小麦矮腥黑穗病W及筛选抗TCK小麦品种方面，可能 是因为感染TCK且未表现病征的病株中，提取DM后，TCK的DM所占比例太小，也就是浓 度太低，而普通PCR的灵敏性不足于检测到如此低浓度的模板。众所周知，实时定量PCR在 灵敏度方面显著优越于普通PCR，因此发明人尝试将该专利中的Scar标记引物用于实时定 量PCR来扩增TCK样本，但是无论是在实时巧光定量方法中还是在化qMan水解探针法定 量PCR中，从不同梯度的扩增曲线和标准曲线及溶解曲线来看，引物的特异性不好，标准曲 线的扩增效率远远超过正常的效率是90-110%，因此引物与模板扩增有问题。
[0006] 为了能顺利利用实时定量PCR方法鉴定小麦矮星黑穗病，有必要通过设计筛选适 合于实时定量PCR方法的特异性PCR引物，优化PCR反应体系得出一套灵敏性高、特异性好 的实时定量检测方法。
【发明内容】
[0007] 本发明根据上述领域的现状及需求，根据前期研究中筛选到的TCK差异基因片段 SeqIDNo. 1，设计出TCK特异性引物及探针，基于AB口500巧光定量扩增仪，优化Real-Time PCR反应体系，成功地建立化qMan水解探针法定量PCR检测体系检测TCK和人工接种体系 下不同生长期小麦的感病情况检测。
[0008] 本发明建立的实时定量化qman探针法检测TCK的技术方案如下；
[0009] 用于鉴定小麦黑穗菌（Tilletiacontroversa肺hn)的化qman探针法，包括如下 步骤：
[0010] (1)获得TCK阳性质粒标准品的实时定量标准曲线，其中Ct值为纵坐标，起始模板 拷贝数为横坐标；
[0011] 似提取待测样品的DNA;
[0012] (3)W所述待测样品的DNA为模板进行实时定量PCR反应，
[0013] (4)根据所述实时定量PCR反应获得的Ct值W及所述实时定量标准曲线得到所述 待测样品中TCK的拷贝数；
[0014] 其特征在于；所述实时定量PCR反应采用的引物及探针如下：
[00巧]上游引物ACGACCGACTTTCCGAGAGC，
[0016]下游引物GTGTGGGACGAAGGCATCAA;
[0017]hginan探针FAM5' -ACGACTTGCGGTCCCTCCACA-3'TAMAR。
[0018] 所述实时巧光定量PCR反应的体系如下；
[0019]
【主权项】
1. 用于鉴定小麦黑穗菌（TilletiacontroversaKUhn)的Taqman探针法，包括如下步 骤： (1) 获得TCK阳性质粒标准品的实时定量标准曲线，其中Ct值为纵坐标，起始模板拷贝 数为横坐标； (2) 提取待测样品的DNA; (3) 以所述待测样品的DNA为模板进行实时定量PCR反应， (4) 根据所述实时定量PCR反应获得的Ct值以及所述实时定量标准曲线得到所述待测 样品中TCK的拷贝数； 其特征在于：所述实时定量PCR反应采用的引物及探针如下： 上游引物ACGACCGACTTTCCGAGAGC， 下游引物GTGTGGGACGAAGGCATCAA; Taqman探针FAM5' -ACGACTTGCGGTCCCTCCACA-3'TAMAR。
2.根据权利要求1所述的Taqman探针法，所述实时荧光定量PCR反应的体系如下：
加入灭菌蒸馏水至20yl。
3. 根据权利要求1所述的Taqman探针法，所述实时荧光定量PCR反应的体系程序如 下：95°C10 分钟，95°C15 秒，60°C60 秒，40 个循环。
4. 用于鉴定小麦黑穗菌（TilletiacontroversaKUhn)的Taqman探针法试剂盒，其 特征在于：包括除DNA模板之外的用于实时荧光定量PCR反应的试剂和标准曲线方程说明 书； 所述试剂中的引物如下： 上游引物ACGACCGACTTTCCGAGAGC， 下游引物GTGTGGGACGAAGGCATCAA; Taqman探针：FAM5' -ACGACTTGCGGTCCCTCCACA-3'TAMAR。 所述标准曲线方程为TCK阳性质粒标准品的实时定量标准曲线的方程，所述标准曲线 的纵坐标为Ct值，横坐标为所述TCK阳性质粒标准品的起始模板拷贝数。
【专利摘要】本发明“采用Taqman探针法鉴定小麦黑穗菌(Tilletia controversa Kühn)的方法及试剂盒”，涉及植物病害检测技术。包括如下步骤：(1)获得TCK阳性质粒标准品的实时定量标准曲线，其中Ct值为纵坐标，起始模板拷贝数为横坐标；(2)提取待测样品的DNA；(3)以所述待测样品的DNA为模板进行实时荧光定量PCR反应，(4)根据所述实时荧光定量PCR反应获得的Ct值以及所述实时定量标准曲线得到所述待测样品中TCK的拷贝数；其特征在于：所述实时荧光定量PCR反应采用的引物如下：上游引物ACGACCGACTTTCCGAGAGC下游引物GTGTGGGACGAAGGCATCAA；Taqman探针FAM 5'-ACGACTTGCGGTCCCTCCACA-3'TAMAR，还提供了基于该方法的试剂盒。
【IPC分类】C12Q1-04, C12R1-645, C12Q1-68
【公开号】CN104774920
【申请号】CN201510018516
【发明人】高利, 陈万权, 蔚慧欣, 刘太国, 刘博
【申请人】中国农业科学院植物保护研究所
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年1月14日