28] 3.培养基：RPMI-1640培养液（含10 %的FBS，青霉素100U/mL，链霉素100U/ mL, 0. 056%NaHC03，调节pH值至7. 4)，0. 22yn滤膜过滤灭菌后4°C保存。
[0029] 说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验 指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书 进行。
[0030] 实施例1
[0031] 草菇免疫调节蛋白FIP-VV〇78编码基因fip-vvo78的筛选和克隆
[0032] 将草菇所有基因序列在Pfam蛋白结构域数据库中搜索，得到9084个分为2970 种的结构域数据信息，然后与灰盖鬼伞、双孢蘑菇、裂褶菌和糙皮侧耳等不含有免疫调节 蛋白的食用真菌基因组的结构域数据相比对，发现草菇免疫调节蛋白FIP-vvo和一个未 知蛋白具有相同的结构域，并且它们的GO注释（G0:0030246和G0:0002682)完全相同， GO注释信息显示这2个基因表达的蛋白都具有免疫调节功能。这个蛋白与草菇免疫调节 蛋白FIP-vvo的相似性达到93%。因此，从草菇基因组出发，通过生物信息学方法，发现 了一种具有免疫调节作用的草葫免疫调节蛋白基因fip-vvo78。根据得到的fip-vvo78 基因序列设计了一对引物FIP-vvo78-F(NdeI5'-CATATGTCTACCGACITGA_3'）和 FIP-vvo78-R(EcoRI5'-CTTAAGTTAITCCACTGGGCA-3'），用基因克隆的方法克隆了 来源于菌株VolvariellavolvaceaV23(其ACCC保藏号为：50897)的草葫免疫调节蛋白 FIP-vvo78基因，DNA全序列分析结果表明，FIP-vvo78全长338bp，其cDNA序列如SEQID NO. 2所示。
[0033] 实施例2
[0034] 重组草菇免疫调节蛋白FIP-VV〇78的制备
[0035] 将表达载体pET_28b(+)进行双酶切（EcoRI和Ndel)，同时将合成的编码草菇 免疫调节蛋白FIP-VV〇78的基因片段双酶切（EcoRI和Ndel)，切出编码成熟草菇免疫调 节蛋白FIP-VV〇78的基因片段与表达载体pET-28b(+)连接，获得含有草菇免疫调节蛋 白FIP-vvo78基因的重组质粒pET-FIP-vvo78并转化大肠杆菌BL21 (DE3)，得到重组菌株 BL21-FIP-vvo78。
[0036] 分别吸取lmL含有重组菌株BL21-FIP-vvo78菌株和含有表达载体pET-28b(+) 的BL21菌株的37°C过夜摇好的新鲜菌液接种于100mL含有（50yg/mL)卡那霉素LB培养 液中，37°C，250rpm/min，2h，0D~0.3，WA200yL50mg/mI^9lPTG，25°C，250rpm/min，$ 导培养4h后，离心收集菌体。然后用于超声破碎（工作3s，间歇5s，工作电压300W，全程 20-30min)，并离心收集上清。研宄结果显示重组草菇免疫调节蛋白FIP-VV〇78的表达量为 196mg/L。SDS-PAGE结果表明，重组草菇免疫调节蛋白FIP-VV〇78在大肠杆菌中得到了表 达。所表达的草菇免疫调节蛋白FIP-VV〇78含量达到电泳纯（图1)。
[0037] 实施例3
[0038] 重组草菇免疫调节蛋白FIP-VV〇78的促细胞因子白介素IL-2分泌活性测定
[0039] 通过ELISA方法检测重组免疫调节蛋白促进人白血病细胞Jurkat细胞分泌白介 素（IL-2)的作用，以测定其免疫调节活性。
[0040] 将Jurkat细胞悬浮液倒入15mL离心管中，1000rpm/min，离心3min，去除上清。 加入2mL的RPMI-1640培养液（含10%的FBS，青霉素100U/mL，链霉素100U/mL，0? 056% NaHC03，调节pH值至7. 4)重新悬浮细胞。将细胞悬浮液转移至培养瓶中，置于37°C、5% C02培养箱内常规培养至对数生长期。
[0041] 将对数生长期的Jurkat细胞悬浮液稀释至1X107细胞/mL，按每孔200yL接种 于96孔培养板，分别加上重组免疫调节蛋白和表达载体蛋白PBS溶液，使总蛋白终浓度为 10yg/mL。另设阴性对照组（只加细胞和培养液，PBS取代样品）和阳性对照组（只加PMA、 PHA、细胞和培养液，不加样品）。每个样品做3个平行孔。在37°C培养箱中培养48h。
[0042] 吸出细胞培养液于1. 5mL离心管中，1000rpm/min，离心3min，收集上清。根据 ELISAKIT96THumanIL-2试剂盒的说明书进行白介素（IL-2)的检测。
[0043] 加入100yL样品、阴性对照组（只加细胞和培养液，PBS取代样品）和阳性对照 组（只加PMA、PHA、细胞和培养液，不加样品）上清，同时取标准品人IL-2,分别稀释至终浓 度为31. 52、125、250、500pg/mL作为阳性对照和制作标准曲线，用PBS做阴性对照，加每个 样品做2个平行孔。
[0044]放于37 °C培养箱中培养90min，小心吸出上清液，每孔350yL洗涤液洗涤4次，倒 置滤纸上，尽量空干液体，最后一次拍干。
[0045] 每孔加入100yL生物素化抗体工作液，放于37°C培养箱中培养60min。洗涤液洗 板同上。
[0046] 每孔加入100yL酶结合物工作液，放于37°C培养箱中培养30min。洗涤液洗板同 上。
[0047] 每孔加入100yL显色液，放于37°C培养箱中暗反应10-20min。
[0048] 每孔加入100yL终止液，立即放入酶标仪，于450nm测定吸光值并记录读数，5min 内完成此步操作。制作标准曲线并计算样品中IL-2含量。
[0049] 研宄结果表明1yg重组草菇免疫调节蛋白FIP-VV〇78促进人白血病细胞Jurkat 细胞分泌白介素2(IL-2)含量在62. 945pg。
【主权项】
1. 一种草菇免疫调节蛋白FIP-VV〇78,其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如SEQID NO. 1所示。
2. -种编码如权利要求1所述的草菇免疫调节蛋白FIP-VV〇78的基因，其特征在于： 所述基因的cDNA序列如SEQIDNO. 2所示。
3. -种含如权利要求1所述的草菇免疫调节蛋白FIP-VV〇78的重组载体。
4. 根据权利要求3所述的一种草菇免疫调节蛋白FIP-VV〇78的重组载体，其特征在于： 所述重组载体为pET-28b(+)。
5. 根据权利要求4所述的一种草菇免疫调节蛋白FIP-VV〇78的重组载体，其特征在于： 将草菇免疫调节蛋白FIP-VV〇78基因插入到pET-28b(+)上的EcoRI和NdeI限制性酶切位 点之间，得到重组载体pET-FIP-vvo78。
6. -种含如权利要求1所述的草菇免疫调节蛋白FIP-VV〇78的重组菌株。
7. 根据权利要求6所述的一种草菇免疫调节蛋白FIP-VV〇78的重组菌株，其特征在于： 所述重组菌株为BL21-FIP-vvo78〇
8. -种草菇免疫调节蛋白FIP-VV〇78的制备方法，包括： (1) 采用权利要求3或4的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株； (2) 培养重组菌株，诱导重组草菇免疫调节蛋白FIP-VV〇78的表达； (3) 超声破碎获取所表达的草菇免疫调节蛋白FIP-VV〇78。
9. 根据权利要求8所述的一种草葫免疫调节蛋白FIP-vvo78的制备方法，其特征在于： 所述步骤（1)中的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)细胞。
【专利摘要】本发明涉及一种草菇免疫调节蛋白FIP-vvo78及其制备方法，蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。制备方法包括：(1)采用重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；(2)培养重组菌株，诱导重组草菇免疫调节蛋白FIP-vvo78的表达；(3)超声破碎获取所表达的草菇免疫调节蛋白FIP-vvo78。根据本发明的对机体具有免疫调节作用的真菌免疫调节蛋白及其基因序列，可以制备出提高人体免疫力的保健食品，防治由于免疫力下降所导致的疾病的危害。
【IPC分类】C12R1-19, C12N1-21, C07K14-375, C12N15-31, C12N15-70
【公开号】CN104817637
【申请号】CN201510217510
【发明人】汪滢, 鲍大鹏, 王莹, 王荣, 唐利华, 茅文俊, 周陈力, 龚明, 李燕, 万佳宁
【申请人】上海市农业科学院
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年4月30日