片段克隆电泳图，M (分子量标准物):DL2000 ；
图3为构建的启动子表达载体(CR6: AUS和CR6m:⑶S)结构示意图。
[0014]图4为CR6: AUS转基因拟南芥植株GUS组织化学染色图。
[0015]图5为CR6m::⑶S转基因拟南芥植株⑶S组织化学染色图。
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施例和附图内容对本发明进一步阐述。
[0017]实施例1:全长启动子和缺失启动子的构建
以拟南芥thaliana, Columbia ecotype)叶片为材料，用 CTAB 法J 1987，6:3901-3907)提取植物总DNA。以植物总DNA为模板，通过特异引物扩增木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶因启动子区的一段间隔重复序列段。
[0018]所述扩增木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶A t2gl462(m因启动子区的特异引物序列如下:
CR6-1 (5，-AAGCTTTTCTTTGGATTGAATAAATCCCCA-3’，如 SEQ ID N0.1 所示，引入了Hindlll 位点)；
CR6-2 (5’ -GGATCCTTAAGATGTTTGAGGTTGAGTACGAT-3’，如 SEQ ID N0.2 所示，引入了BaiMi 位点)；
CR6-4 (5’-GGATCCTGTGTTTAAAGTAAAT-3’，如 SEQ ID N0.3 所示，引入了 BanRl 位点)。
[0019]其中引物CR6-1/CR6-2扩增出712bp全长启动子片段(命名为CR6)(图1)，引物CR6-1/CR6-4扩增的556bp片段(命名为CR6m)(图2)。PCR产物CR6和CR6m直接与pGEM_T克隆载体(购自Promaga)连接，转化DH5 α大肠杆菌感受态菌株，筛选阳性克隆(内含有全长启动子片段CR6和突变的启动子片段CR6m)。
[0020]实施例2:⑶S融合表达载体的构建
用限制性酶Λ?αΙΙΙΙ和分别双酶切实施例1中的两种阳性克隆及双元表达载体pBI121 (购自北京天恩泽基因有限公司，实验室保存)，将酶切后的全长启动子及缺失启动子片段分别与PBI121酶切片段连接，构建启动子表达载体(CR6: AUS和CR6m::⑶S)(图
3)，分别把它们转化到DH5 α大肠杆菌感受态菌株中，进行扩繁。
[0021]实施例3:农杆菌转化
将构建好的表达载体(CR6: AUS和CR6m::⑶S)转入农杆菌宿主细胞EHA105 (国家微生物资源库WWW.matrs.com获得，产品ID为20110114049，实验室保存)中。具体方法如下:构建的表达载体(CR6::⑶S和CR6m::⑶S)大肠杆菌菌株接种到1mL含Km (50 μ g/mL) LB液体培养基中，37°C过夜培养后，提质粒，为后续转化农杆菌备用。EHA105农杆菌菌株接种5mL含Sm (50 μ g/mL) YEP液体培养基中，28°C下200rpm培养48小时。离心收集菌体，用0.1M冰冻CaCl2重悬，冰上放置20分钟后，4°C下5000rpm离心2分钟，收集的菌体用200 μ L0.1M冰冻CaCl2悬浮。然后加入制备好的表达载体质粒(CR6: AUS和CR6m::⑶S)，冰上放置20分钟，_70°C放置10分钟，37°C放置5分钟后加入800 μ L不含抗生素的YEP液体培养基，28°C培养4小时后，离心收集菌体，用玻璃涂棒涂布与含有Km(50 μ g/mL)和Sm(50 μ g/mL)的YEP固体培养基平板上，28°C培养2天。用特异性引物对菌落进行PCR鉴定，筛选阳性克隆。
[0022]实施例4:拟南芥转化
将含表达载体(CR6::⑶S和CR6m::⑶S)的农杆菌菌株(实施例3中已构建)接种于含Km (50 μ g/mL)和Sm (50 μ g/mL)的YEP培养基中，培养至对数生长期，离心收集菌体，重悬于MMA溶液(1mM MES、100 μ M乙酰丁香酮、1mM MgCl2),并调整菌液浓度至0D_=1.2，28°C静置2小时。取生长10天的拟南芥植株，将其放置于MMA溶液中，25°C人工气候箱内黑暗培养48小时后取样进行⑶S组织化学染色。
[0023]实施例5:⑶S组织化学染色
将实施例4中的拟南芥植株取出，用吸水纸吸干后置于含有ImM X-Gluc染色液中，37°C温育5小时，样品经75%乙醇脱水后观察照相。结果见图4和图5，含有间隔重复序列的全长启动子CR6的转基因植株表达较高的GUS活性，而间隔重复序列突变的启动子CR6m几乎检测不到表达的⑶S活性。
【主权项】
1.一种间隔重复序列在提高植物目的基因表达活性中的应用，其特征在于，所述间隔重复序列为拟南芥iAa7ia/?a)木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶J 相'堪因启动子区上的一段间隔重复序列，其序列如SEQ ID N0.4所示；所述的植物为转基因植物。
2.根据权利要求1所述的一种间隔重复序列在提高植物基因表达活性中的应用，其特征在于，所述的植物为拟南芥。
3.根据权利要求1所述的一种间隔重复序列在提高植物基因表达活性中的应用，其特征在于，其中所述的目的基因为β -D-葡糖醛酸酶(GUS)基因。
4.根据权利要求1所述的一种间隔重复序列在提高植物基因表达活性中的应用，其特征在于，其中所述扩增木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶因启动子区的特异引物序列如下: CR6-1:5’ -AAGCTTTTCTTTGGATTGAATAAATCCCCA-3’，如 SEQ ID N0.1 所示，引入了Hindlll 位点； CR6-2:5’ -GGATCCTTAAGATGTTTGAGGTTGAGTACGAT-3’，如 SEQ ID N0.2 所示，引入了BaiMi位点； CR6-4:5’ -GGATCCTGTGTTTAAAGTAAAT-3’，如 SEQ ID N0.3 所示，引入了 BanRl 位点； 其中，下划线部分为酶切位点位置，引物CR6-1/CR6-2扩增出全长启动子片段命名为CR6，引物CR6-1/CR6-4扩增的不包含间隔重复序列的片段命名为CR6m。
5.一种启动子表达载体CR6::⑶S，其特征在于，所述启动子表达载体CR6: AUS包含⑶S基因和木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶因全长启动子片段。
【专利摘要】本发明涉及一种可以提高植物基因表达活性的间隔重复序列，即拟南芥一木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶At2g14620基因启动子上的一段间隔重复序列在转基因植物拟南芥中提高目的基因表达中的用途。当把该间隔重复序列删除时，启动子活性急剧降低，因此，该间隔重复序列具有增强基因表达的特征。应用本发明的间隔重复序列进行植物的转基因研究，可以提高目标基因的表达，具有重要的经济和社会效益。
【IPC分类】C12N15-82, A01H5-00, C12N15-113
【公开号】CN104830860
【申请号】CN201510211645
【发明人】曹军, 李翔, 吕月庆
【申请人】江苏大学
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年4月30日