一种核苷类药物中间体2’-脱氧鸟苷的生产方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，涉及生物催化法制备2’ -脱氧鸟苷的技术领域，具体为一种核苷类药物中间体2’ -脱氧鸟苷的生产方法。
[0002]
【背景技术】
[0003]2 '-脱氧鸟苷是一种天然的脱氧核苷，可直接用于制备组合脱氧核苷药物或者作为化学试剂用于生化研宄；同时可作为中间体用于合成一些抗病毒核苷类药物以及分子标记物，如文献(Journal of Medicinal Chemistry, 1985, 28:1194-1198)以 2’-脱氧鸟苷原料合成8-溴-2’ -脱氧鸟苷和8-羟基-2’ -脱氧鸟苷等重要分子标记物；文献(Tetrahedron Letters, 1982, 23 (22):2253-2256, 1982 Tetrahedron Letters, 1990,31 (3):319-322)中报道了合成2’-脱氧鸟苷的6位衍生物，如6-甲氧基、6-氨基等系列重要抗肿瘤的2’ -脱氧鸟苷衍生物；另外中国专利CN201110114010公开报道了采用2’ -脱氧鸟苷为原料合成致癌或抗癌过程中的重要分子标记物N7-鸟嘌呤烷化物。
[0004]由于采用化学法合成2’ -脱氧鸟苷的收率极低，因此，目前，工业上2’ -脱氧鸟苷生产方法采用DNA水解法，即从DNA水解液中萃取与分离得到。因此，人们开始着手于采用生物法来制备2’ -脱氧鸟苷。
[0005]中国专利CN201010611733和文献(药物生物技术，2011，18⑵:119-123)报道了以鸟苷酸(5’ -单磷酸鸟苷)为原料，采用乙酰短杆菌的核苷磷酸化酶和磷酸单酯酶双酶作用下催化合成2’ -脱氧鸟苷，该方法除产物2’ -脱氧鸟苷外，还生成了鸟苷，不利于后续分离纯化。
[0006]日本有机合成药品工业株式会社的三上洋一(Yoichi Mikanmi )等(中国专利CN200510137532、CN200510137533、CN200510137534、CN01110115、US20010034047AUUS20040067558A1以及US20040072303A1等同族专利)报道了先将鸟嘌呤与乙二醛进行反应生成乙二醛-鸟嘌呤复合体来提高鸟嘌呤的溶解度，转化完毕后再经碱解脱去乙二醛基团生成2’ -脱氧鸟苷；该方法虽然一定程度上提高2’ -脱氧鸟苷的转化产率，但所用乙二醛对人体健康以及环境仅有危害。
[0007]欧洲专利EP1457568、美国专利 US20050170470A1 和世界专利 W02003057895A1 采用鸟苷、5’ -单磷酸鸟苷、2-氨基-6-氯嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤作为脱氧核糖受体来制备2 ’ -脱氧鸟苷或2 ’ -脱氧鸟苷前提物(如5 ’ -单磷酸2 ’ -脱氧鸟苷、2-氨基-6-氯-2 ’ -脱氧核苷、2，6-二氨基_2’ -脱氧核苷)前提物再经处理得到2’ -脱氧鸟苷，如5’ -单磷酸2’ -脱氧鸟昔水解脱去5’ -憐酸基得到2’ -脱氧鸟昔，而2_氛基-6-氣_2’ -脱氧核昔和2，6_ 二氨基-2’ -脱氧核苷则再腺苷脱氨酶作用下，将6-氯(-Cl)或6-氨基(-N2H)位替代基团转换成6-酮基(=0)。
[0008]美国专利US6197552 和文献(Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic,2000，10:207 - 213)同样报道了采用2，6- 二氨基嘌呤作为脱氧糖基受体合成2’ -脱氧鸟苷前提物 2，6-二氨基 _2’ -脱氧核苷。文献(B1sc1.B1technol.B1chem., 2003,67
(5):989 - 995)报道了采用2-氨基-6-氯嘌呤作为脱氧糖基受体合成2’ -脱氧鸟苷前提物2-氨基-6-氯-2’ -脱氧核苷。
[0009]但由于鸟嘌呤难溶于水，这是鸟嘌呤作为糖基受体的瓶颈之处，为了提高2’ -脱氧鸟苷转化产率，关键措施是提高鸟嘌呤在转化体系的溶解度。但是从上述报道来看，基本上很少关注于如何提高鸟嘌呤在转化体系中溶解度的问题，而是着重鸟嘌呤的替代前提物(如鸟苷酸、鸟苷、2-氨基-6-氯嘌呤以及2，6- 二氨基嘌呤)方面，虽然这些替代前提物与鸟嘌呤相比，在转化体系溶解度大大提高，使得2’ -脱氧鸟苷终转化产率一定程度上得到提高，但是存在转化率偏低、替代前提物不易获得以及副产物增加等缺陷。
[0010]双水相系统是指将两种不同水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合物浓度达到一定值时，体系会自然地分成互不相溶的两相，两相中均含有水分，构成了双水相体系。双水相技术早期主要用于生物分子和细胞的分离与纯化，近年来开始应用于微生物催化过程，为酶催化过程引入了一种全新的反应体系。
[0011]
【发明内容】
[0012]本发明的目的在于提供一种核苷类药物中间体2’-脱氧鸟苷的生产方法。该方法将双水相系统应用到生物催化制备2’ -脱氧鸟苷的工艺中，解决以往鸟嘌呤在转化体系中溶解度低的瓶颈问题，可大大增加鸟嘌呤溶解度，大副度提高转化率。
[0013]为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案:
一种核苷类药物中间体2’ -脱氧鸟苷的生产方法，是采用产脱氧核苷核糖转移酶的发酵乳杆菌CGMCC 1.1880菌体浆状物为生物催化剂，在聚乙二醇(PEG) /无机盐双水相转化体系，以胸苷和鸟嘌呤为原料进行酶促反应，最后获得2’ -脱氧鸟苷。
[0014]所述的双水相转化体系中所用多聚物为聚乙二醇，所选的种类有PEG4000、PEG8000、PEG10000, PEG15000 和 PEG20000。其优选为 PEG10000 和 PEG15000，其最优选为PEG10000。所述聚乙二醇的浓度为25g/L-55g/L，包括25g/L、45g/L和55g/L，优选PEG10000的的浓度为45g/L。
[0015]本发明双水相转化体系中所用无机盐为磷酸盐，所选的盐种类有磷酸二氢钾、磷酸二氢钠和磷酸二氢钱，优选为磷酸二氢钾。磷酸盐的浓度为30g/L-60g/L，包括30g/L、45g/L和60g/L，优选磷酸二氢钾的浓度为45g/L。
[0016]本发明所用的底物为胸苷和鸟嘌呤，其中胸苷浓度为16.5g/L，鸟嘌呤所选的浓度为 10.3g/L-18.0g/L，包括 10.3g/L、15.2g/L 和 18.0g/L，优选浓度为 15.2g/L ；β-胸苷和鸟嘌呤摩尔比为1:1-2，包括1:1、1:1.5和1:2，优选的比例为1:1.5。
[0017]β-胸苷是目前五种脱氧核苷(2’_脱氧腺苷、2’-脱氧尿苷、2’-脱氧胞苷、2’-脱氧鸟苷和胸苷)中最易得、价廉的脱氧糖基供体，而鸟嘌呤相比于其它含鸟嘌呤结构的物质，如鸟苷、鸟苷酸或者2，6_ 二氨基嘌呤等，是最为直接、易得和价廉的脱氧核糖受体，因此，采用生物催化法制备2’ -脱氧鸟苷，鸟嘌呤和β-胸苷作为初始底物是最理想的组入口 ο
[0018]本发明的积极效果体现在: (一)、该方法将双水相系统应用到生物催化制备2’-脱氧鸟苷的工艺中，解决以往鸟嘌呤在转化体系中溶解度低的瓶颈问题，可大大增加鸟嘌呤溶解度，大副度提高转化率。
[0019](二)、本发明中的生物催化法生产2’ -脱氧鸟苷，产率最大达到可达16.lg/L，β-胸苷转化率可达89%。
[0020]【具体实施方式】:
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
[0021]下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。
[0022]由于产脱氧核苷核糖转移酶的菌株发酵乳杆菌CGMCC 1.1880 (CGMCC为中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microb1logical Culture Collect1nCenter)的简称)的斜面培养基、种子培养基和发酵产酶培养基及培养条件采用本领域公知的技术，下面具体实施例菌采用统一的培养基及培养条件。
[0023]斜面培养基组成(g/L)以及培养条件:
葡萄糖糖5、酵母浸粉10、磷酸氢二钾1、七水硫酸镁0.5、硫酸锰0.01，甘油5、酶解酪蛋白胨2、琼脂25、pH值7.5 ;培养温度35°C、，培养24-48小时。
[0024]种子培养基组成(