L-鸟氨酸酶法转化制备方法
【专利说明】L-鸟氨酸酶法转化制备方法 一、技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种L-鸟氨酸酶法转化制备方法。 二、【背景技术】
[0002] L-鸟氨酸（L-Ornithine)是一种非蛋白氨基酸，主要存在于肉类、鱼类、奶酪中， 也是细菌细胞膜和多肽类抗生素的组成成分，在人体内主要以游离态存在于肝脏。L-鸟氨 酸最主要的生理功能是参与尿素循环，有着强大的氨解毒功能，因此被广泛应用于治疗肝 性脑病、肝炎以及保护肝脏方面的药物研发，如L-鸟氨酸-L-天冬氨酸，L-鸟氨酸苯乙酸 等。此外，L-鸟氨酸还有很多其他生物功能，如刺激生长激素分泌、改善睡眠、缓解疲劳，还 能用作食品添加剂改善食品风味。随着人们对L-鸟氨酸认识的加深，其生理功效将会进一 步引起世人关注。
[0003] 根据文献报道，L-鸟氨酸的制备方法主要有化学法、发酵法和酶转化法。
[0004] 1、化学法
[0005]George(US3168558)利用丙稀醛、氰化氢、氨气、C02为原料合成L-鸟氨酸，但 效果不理想，主要表现为反应步骤多、产品为消旋的DL-鸟氨酸。Nesmeyanov(RussChem B, 1957 (4) : 459-466;JOrgChem, 1963, 28 (7) : 1942-1943)分别以 1，1，5-三氯-1-戊烯或 2, 5-二氯戊酸为起始反应物生产鸟氨酸，减少了反应步骤，但产物仍然为DL-鸟氨酸。化学 法合成鸟氨酸反应步骤多、收率低，且得到的是消旋体，需要拆分，不适宜大规模生产L-鸟 氨酸产品。
[0006] Rivard(JAmChemSoc,1955, 77(5) : 1260-1261)利用 8&(011)2水解L-精氨酸， 经水解、除盐和干燥后，得到L-鸟氨酸盐酸盐，水解过程中存在消旋现象，产品光学纯度不 高。刘爱福（CN1594282A)将水解工艺优化调整，解决了水解过程中L-鸟氨酸消旋，产品 总收率达到80 %，但碱水解L-精氨酸法存在产品回收率低，催化剂难以重复利用的缺点。
[0007] 2、发酵法
[0008] 发酵法因原料低廉受到研宄者的青睐，近年来取得了很大进展，主要表现在生产 菌株的选育和生产工艺的改造方面。
[0009] 日本研宄人员早在20世纪50年代就利用紫外、氰化物等传统的诱变技术，获 得了谷氨酸棒杆菌瓜氨酸缺陷型突变株，成功积累了L-鸟氨酸。到了 20世纪90年代， TsUchida(US5188947)发现给予霉酚酸等抗性标记后，L-鸟氨酸质量浓度可提高到40~ 55g/L。万红贵（CN101955901A)公开了利用CorynebacteriumglutamicumCGMCCNo.3663 发酵制备L-鸟氨酸的方法，发酵液中L-鸟氨酸积累达到35~45g/L。
[0010] 但发酵法也有不足之处，菌种的不稳定性、发酵工艺参数控制、发酵液中L-鸟氨 酸的分离提取等过程都存在亟待解决的问题。
[0011] 3、酶转化法
[0012] 酶法转化因具有专一性强、催化效率高、反应条件温和、反应周期短、产物易于分 离等优点而日益受到重视，是低成本生产L-鸟氨酸的有效方法。
[0013]Makryaleas(US5405761)研宄了精氨酸酶（EC3. 5. 3. 1)制备L-鸟氨酸的工艺， 在pH8.0~10.0时转化率可达99%。王雷（CN101348808A)利用从牛肝中提取的牛肝 酶液和从黄豆中提取脲酶双酶耦合转化L-精氨酸制备L-鸟氨酸，产品收率80~85 %。 高智慧（CN102286602A)利用重组表达的精氨酸酶基因工程菌酶法拆分DL-精氨酸制备 D-精氨酸和L-鸟氨酸，产品L-鸟氨酸盐酸盐纯度95%以上。张鹏（CN1908177A)在粪 肠球菌（Enterococcusfaecalis)CGMCCNO. 1786发酵液中加入精氨酸底物酶法转化制备 L-鸟氨酸，产物含量达到90~112g/L。焦庆才（CN1661026A)采用固定化细胞酶法水解 L-精氨酸，底物转化率95%以上，L-鸟氨酸得率80%以上。张奇（CN102286563A)利用 纤维素载体固定化重组表达的精氨酸酶，用交联剂交联后酶法转化底物L-精氨酸，前10次 使用底物转化率90%以上。
[0014] 综上所述，酶法制备L-鸟氨酸的方法中以精氨酸酶水解法最接近工业化应用，但 反应底物L-精氨酸成本相对较高。鉴于L-鸟氨酸发酵技术的发展，目前以高纯度L-精氨 酸为原料酶法制备L-鸟氨酸的工业化技术难以长期与L-鸟氨酸发酵法生产技术相竞争， 因此寻找来源丰富、成本低廉的L-精氨酸工业原料并实现酶法生产L-鸟氨酸关键技术的 突破是本发明的根本目的。 三、
【发明内容】
[0015] 本发明需要解决的问题是提供一种高效、低成本酶法制备L-鸟氨酸的方法。本发 明利用含有精氨酸的料液或精氨酸粗品或精氨酸盐粗品为底物配制酶转化液，加入具有精 氨酸酶活性的菌体细胞或粗酶液，催化水解制得L-鸟氨酸。
[0016] 本发的明技术方案：
[0017] (1)将具有精氨酸酶活性的菌株在培养基中培养，产生高酶活精氨酸酶；
[0018] (2)含有精氨酸的发酵液或含有精氨酸的离子交换洗脱液或精氨酸粗品或精氨酸 盐粗品加水配制的底物溶液，用氨水或无机酸调pH7~11，加入精氨酸酶细胞或酶粗提 液，再加入表面活性剂，在25~55°C条件下进行酶促反应，转化反应结束后利用等电点结 晶和离子交换相结合的方法分离制备转化产物L-鸟氨酸盐酸盐。
[0019] 上述步骤（1)所述的精氨酸酶来源于粪肠球菌或产碱杆菌或芽孢杆菌或栖息微 球菌。培养基碳源采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和/或果糖，培养基中总碳源质量浓度为1~ 30g/L;氮源采用牛肉膏、酵母膏、玉米浆、蛋白胨和/或豆饼水解液，培养基中总氮源质量 浓度为1~30g/L。
[0020] 上述步骤（2)所述的精氨酸发酵液中含有精氨酸质量浓度为10~150g/L;
[0021] 含有精氨酸的离子交换洗脱液中精氨酸质量浓度为10~150g/L;精氨酸粗 品或精氨酸盐粗品中精氨酸重量比含量为50 %~95 %，配制的粗品底物水溶液质量浓 度为50~200g/L。所述的表面活性剂为吐温-80或十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)或 TritonX-100或聚乙二醇辛基苯基醚（0P)，其终浓度为0. 1~1.Og/L。
[0022] 本发明与现有技术相比其有益效果是：
[0023]目前，我国L-精氨酸生产主要来源于角蛋白水解提取法和发酵法，生产过程中 L-精氨酸的分离精制和浓缩结晶及干燥工序增加了成品L-精氨酸的成本，而酶法转化对 底物L-精氨酸的纯度要求不高，因此利用发酵法生产L-精氨酸的发酵液或离子交换分离 的粗提液以及L-精氨酸粗品或L-精氨酸盐的粗品为原料酶法制备L-鸟氨酸可大大降低 生产成本。本发明以含精氨酸的料液或L-精氨酸粗品或L-精氨酸盐粗品加水配制的溶液 为底物，利用精氨酸酶催化水解制备L-鸟氨酸，解决了精氨酸酶酶法水解制备L-鸟氨酸工 艺的廉价原料问题，使生产成本大幅度降低，具有重大突出效果和工业化价值。
[0024] (1)本发明利用精氨酸酶催化水解L-精氨酸制备L-鸟氨酸，酶法转化效率高，摩 尔转化率达到99%以上。
[0025] (2)本发明采用发酵法生产L-精氨酸的发酵液或离子交换分离的粗提液以及 L-精氨酸粗品或L-精氨酸盐的粗品为原料，充分利用了工业生产过程物料，省去了精氨酸 的分离、精制及干燥工序，降低了酶法生产L-鸟氨酸的原料成本，实施效果突出，具有良好 的经济效益和社会效益。
[0026] (3)酶促反应生成的L-鸟氨酸可利用等电点结晶和离子交换相结合的方法分离 制备，得到L-鸟氨酸盐酸盐。
[0027] (4)酶法制备L-鸟氨酸具有转化反应条件温和，酶立体选择性强，成本低，工艺流 程简单、设备投资少等优点，适合工业化大规模生产。 四、【具体实施方式】
[0028] 实施例一
[0029]L-鸟氨酸酶法转化制备方法由以下步骤构成：
[0030] (1)将具有精氨酸酶活性的菌株粪肠球菌或产碱杆菌或芽孢杆菌或栖息微球菌在 培养基中培养，培养基碳源采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和/或果糖，培养基中总碳源质量浓 度为1~30g/L;氮源采用牛肉膏、酵母膏、玉米浆、蛋白胨和/或豆饼水解液，培养基中总 氮源质量浓度为1~30g/L，产生高酶活精氨酸酶；
[0031] (2)将含有精氨酸质量浓度为10~150g/L的精氨酸发酵液，或含有精氨酸质量 浓度为10~150g/L的精氨酸离子交换洗脱液，或精氨酸重量比含量为50 %~95 %的精 氨酸粗品或精氨酸盐粗品，加水配制成底物溶液，配制的粗品底物水溶液质量浓度为50~ 200g/L，用氨水或无机酸调pH7~11，加入精氨酸酶细胞或酶粗提液，再加入表面活性剂 吐温-80或十六烷基三甲基溴化铵或TritonX-100或聚乙二醇辛基苯基醚，其终浓度为 0. 1~1.Og/L，在25~55°C条件下进行酶促反应，转化反应结束后利用等电点结晶和离子 交换相结合的方法分离制备转化产物L-鸟氨酸盐酸盐。
[0032] 实施例二
[0033] 1.将粪肠球菌ATCC8043在如下1000ml培养基（g/ml)中培养：玉米浆2. 0%， 蛋白质水解物〇. 5%，牛肉膏1%，麦芽糖1.0%，乳糖0. 5%，NaCl0. 5%，KH2P040. 5%， MgS04 ? 7H20 0? 03%，pH7. 2。37°C振荡培养 16h，4000r/min离心 15min得湿细胞 18g。
[0034] 2.将湿菌体加入到1000ml转化液中，转化液