专利名称：一种酶转化生产l-鸟氨酸硝酸盐的方法
技术领域：
本发明涉及L-鸟氨酸硝酸盐的生产，尤其是涉及一种酶转化生产L-鸟氨酸硝酸盐的方法。
背景技术：
在生物体内，L-鸟氨酸主要参与尿酸循环，对于体内氨态氮的排出有重要作用。 L-鸟氨酸可作为原料药外，还可作为食品和保健品的添加剂。近年来，L-鸟氨酸在食品工业和医药工业上的应用日益广泛。由于L-鸟氨酸盐类在体内经氧化酶等转化最后转变呈L-鸟氨酸，容易被身体吸收，所以L-鸟氨酸一般都做成L-鸟氨酸盐类。近年来美国有关方面研究发现，氨基酸的硝酸盐更有利于氨基酸在体内的吸收，因此将L-鸟氨酸制作成呢个L-鸟氨酸硝酸盐服用， 将更容易在体内转化成L-鸟氨酸，被身体吸收，其使用时剂量会更小，吸收好，组织分布更广。但是目前世界上还没有见能工业化生产L-鸟氨酸硝酸盐产品的报道。
发明内容
本发明的目的就是提供一种成本低、高质量、高收率的、可工业化生产的酶转化生产L-鸟氨酸硝酸盐的方法。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现一种酶转化生产L-鸟氨酸硝酸盐的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤(1)固定化酶的制备取三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂，用碳酸钾溶液浸泡6_18h、过滤，滤干后加入碳酸钾溶液和溴化钾溶液，于冰浴中反应5-60min，采用冷碳酸氢钠溶液调节pH值至7_10，再加入精氨酸酶溶液，于1-10°C反应12-4 ，再依次用碳酸氢钠、氯化钠、去离子水洗涤，最后用饱和食盐水浸泡0. 5-3h，再洗净即制得固定化酶，保存于水中；所述的三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂与碳酸钾、溴化钾、精氨酸酶的质量比为1 (0.3-1.4) (0.1-1.4) (0. 001-0 01)；(2) L-鸟氨酸硝酸盐的制备将步骤(1)中制得的固定化酶与精氨酸、乙酸锰按质量比 1 (1-3) (0.002-0.008)混合，溶于去离子水中，采用硝酸调节pH值至5-6，在30-50°C 下，搅拌反应6-10h，过滤；(3) L-鸟氨酸硝酸盐的分离纯化在步骤(2)过滤得到的滤液中加入活性炭，用硝酸调节pH值至2-5. 5，于40_90°C 下搅拌反应5-30min后，过滤，将滤出液浓缩至有结晶析出，停止浓缩，加入乙醇，搅拌 0. 5-池，析出L-鸟氨酸硝酸盐，过滤、干燥即得产品。步骤(1)所述的三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂与碳酸钾、溴化钾、精氨酸酶的质量比为 1 (0. 35-0. 55) (0. 4-1) (0. 008-0. 01)。
步骤⑴所述的碳酸钾溶液的摩尔浓度为1-5M，溴化钾是质量浓度为l_4g/ml的溶液，所述的精氨酸酶是质量浓度为l_4g/l的溶液，所述的冷碳酸氢钠溶液的摩尔浓度为 0.05-2M。步骤(1)所述的洗涤是依次利用0. 05-0. 3M的碳酸氢钠溶液，0. 5_4M的氯化钠溶液和去离子水各洗涤2-5次，每次用量为100-400ml。步骤(1)所述的饱和食盐水的加入量以能浸没固定化酶为准。步骤⑵所述的固定化酶与精氨酸、乙酸锰按质量比 1 (1.4-1.6) (0.004-0.006)。步骤⑵所述的硝酸的加入量根据pH值确定。步骤⑵所述的搅拌反应的搅拌速度为60_200rpm。所述的步骤(3)中活性炭的加入量为l_6g/100ml滤液。与现有技术相比，本发明具有生产成本低、生产条件温和、转化体系中杂质较少、 工艺步骤简单、生产操作安全等优点，采用本发明生产的L-鸟氨酸硝酸盐纯度高，产量高， 每升溶液中含有100g-130g的L-鸟氨酸硝酸盐。精氨酸的转化率可达到95%以上。L-鸟氨酸硝酸盐是重要的医药工业基础原料，是细胞中重要的代谢产物，对于生物体内液态氨的排除有重要的调节作用。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。实施例1一种酶转化生产L-鸟氨酸硝酸盐的方法，该方法包括如下步骤1、固定化酶的制法(1)原料用量三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂50g精氨酸酶400mg饱和食盐水以能浸没固酶为准(2)操作过程将三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂50g，用2M碳酸钾溶液浸泡12h，过滤。滤干后，加入 100ml2M碳酸钾溶液，于冰浴下加入IOml溴化钾(2g/ml)于冰浴下反应15分钟，用冷0. IM 碳酸氢钠洗至PH = 8. 5，加入精氨酸酶溶液100ml (约400mg) 4°C反应Mh。依次用0. IM碳酸氢钠、IM氯化钠、去离子水洗涤3次，每次200ml。用饱和食盐水浸泡固化酶1小时，洗净至检测不出氯离子，保存于水中，备用。2、L-鸟氨酸硝酸盐的制备备料精氨酸80g
湿固酶50g
纯水160g
乙酸锰0.3g
硝酸根据pH确定用量在上述条件下，将步骤(1)中制得的固定化酶(湿固酶)50g与精氨酸80g、乙酸锰0. 3g混合，溶于160g纯水中，采用硝酸调节pH值至5. 0 5. 5，在40_42°C下，搅拌反应 10小时；精氨酸转化率达到95 98%。每升反应液中含约130g L-鸟氨酸硝酸盐。反应结束后，过滤，滤饼(固相酶)保存于水中，下次备用。3、L-鸟氨酸硝酸盐的分离纯化在步骤⑵反应结束过滤后的滤液中加入3g活性炭，硝酸调节pH = 3.1，70°C保温搅拌20分钟，过滤，滤液浓缩至有结晶析出，停止浓缩，加入200ml乙醇，搅拌1小时，析出的L-鸟氨酸硝酸盐经过滤，洗涤干燥，得65gL-鸟氨酸硝酸盐，收率81. 25% (w/w)。实施例2(1)固定化酶的制备取三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂40g，用摩尔浓度为IM的碳酸钾溶液浸泡他后过滤，滤干后，加入摩尔浓度为IM的碳酸钾溶液10ml，质量浓度为lg/ml的溴化钾溶液5ml于冰浴条件下反应5min，用摩尔浓度为0. 05M的碳酸氢钠溶液调节溶液pH值至7，再加入质量浓度为lg/Ι的精氨酸酶溶液50ml，于IV反应12h，依次用摩尔浓度为0. 05M的碳酸氢钠溶液100ml、0. 5M的氯化钠溶液100ml、去离子水IOOml洗涤2次，最后用饱和食盐水浸泡 0.证，洗净即制得固定化酶，保存于水中；(2) L-鸟氨酸硝酸盐的制备将步骤(1)中制得的固定化酶与精氨酸、乙酸锰按质量比1 1.4 0.004混合溶于IOOml去离子水中，利用硝酸调节溶液pH值至5. 0-5. 5，在30°C，搅拌速度60rpm的条件下，搅拌反应10h，得到混合液；(3)产物提取和精制将步骤O)中制得的反应液进行过滤，向滤液中加入Ig活性炭，控制溶液pH = 4. 5，反应温度40°C，搅拌5min后过滤，滤出液浓缩至有结晶析出，停止浓缩，加入120ml乙醇，继续搅拌0. 5h，析出L-鸟氨酸硝酸盐，经过滤，干燥后得到62g，L-鸟氨酸硝酸盐收率 77. 5% (w/w)。实施例3(1)固定化酶的制备取三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂50g，用摩尔浓度为2M碳酸钾溶液浸泡1 后过滤， 滤干后，加入摩尔浓度为2M的碳酸钾溶液100ml，质量浓度为2g/ml的溴化钾溶液IOml于冰浴条件下反应15min，用摩尔浓度为0. IM的碳酸氢钠溶液调节溶液pH值至8. 5，再加入质量浓度为4g/L的精氨酸酶溶液100ml，于4V反应Mh，依次用摩尔浓度为0. IM的碳酸氢钠溶液200ml、摩尔浓度为IM的氯化钠溶液200ml、去离子水200ml洗涤3次，最后用饱和食盐水浸泡lh，洗净即制得固定化酶，保存于水中；(2) L-鸟氨酸硝酸盐的制备将步骤(1)中制得的固定化酶与精氨酸、乙酸锰按质量比1 1.4 0.008混合溶于120ml去离子水中，利用硝酸调节溶液pH值至7. 5，在40°C，搅拌速度60rpm的条件下， 反应他，得到混合液；(3) L-鸟氨酸硝酸盐的分离纯化将步骤⑵中制得的混合液进行过滤，向滤液中加入2g活性炭，控制溶液pH = 2， 反应温度50°C，搅拌IOmin后过滤，滤出液浓缩至有结晶析出，停止浓缩，加入150ml乙醇， 继续搅拌1.证，析出L-鸟氨酸硝酸盐，经过滤，干燥后得到60g，L-鸟氨酸硝酸盐收率75% (w/w)ο实施例4(1)固定化酶的制备取三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂60g，用摩尔浓度为5M碳酸钾溶液浸泡1 后过滤， 滤干后，加入摩尔浓度为4M的碳酸钾溶液150ml，质量浓度为4g/ml的溴化钾溶液20ml于冰浴条件下反应40min，用摩尔浓度为2M的碳酸氢钠溶液调节溶液pH值至10，再加入质量浓度为2g/l的精氨酸酶溶液200ml，于8°C反应48h，依次用摩尔浓度为0. 3M的碳酸氢钠溶液400ml、摩尔浓度为4M的氯化钠溶液400ml、去离子水400ml洗涤5次，最后用饱和食盐水浸泡池，洗净即制得固定化酶，保存于水中；(2) L-鸟氨酸硝酸盐的制备将步骤(1)中制得的固定化酶与精氨酸、乙酸锰按质量比1 1.4 0.02混合溶于200ml去离子水中，利用硝酸调节溶液pH值至5. 5，在50°C，搅拌速度60rpm的条件下， 搅拌反应他，得到混合液；(3) L-鸟氨酸硝酸盐的分离纯化将步骤⑵中制得的混合液进行过滤，向滤液中加入6g活性炭，控制溶液pH = 6，反应温度90°C，搅拌30min后过滤，滤出液浓缩至有结晶析出，停止浓缩，加入500ml乙醇，继续搅拌3h，析出L-鸟氨酸硝酸盐，经过滤，干燥后得到57g，L-鸟氨酸硝酸盐收率 71. 25% (w/w)。实施例5一种酶转化生产L-鸟氨酸硝酸盐的方法，该方法包括如下步骤(1)固定化酶的制备取三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂，用摩尔浓度为IM碳酸钾溶液浸泡18h、过滤，滤干后加入摩尔浓度为IM碳酸钾溶液和质量浓度为lg/ml溴化钾溶液，于冰浴中反应60min， 采用摩尔浓度为0. 05M冷碳酸氢钠溶液调节pH值至7，再加入质量浓度为lg/Ι的精氨酸酶溶液，于1°C反应48h，再依次用0. 05M碳酸氢钠100ml、0. 5M氯化钠100ml、去离子水洗涤100ml，最后用饱和食盐水浸泡0.证，饱和食盐水的加入量以能浸没固定化酶为准，再洗净至检测不出氯离子即制得固定化酶，保存于水中；所述的三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂与碳酸钾、溴化钾、精氨酸酶的质量比为1 0.3 0. 1 0.001 ；(2) L-鸟氨酸硝酸盐的制备将步骤(1)中制得的固定化酶与精氨酸、乙酸锰按质量比1 1 0.002混合，溶于去离子水中，采用硝酸调节PH值至5，在30°C下，搅拌反应10h，搅拌速度为60rpm，过滤；(3) L-鸟氨酸硝酸盐的分离纯化在步骤( 过滤得到的滤液中加入活性炭，活性炭的加入量为lg/100ml滤液，用硝酸调节PH值至2，于40°C下搅拌反应30min后，过滤，将滤出液浓缩至有结晶析出，停止浓缩，加入乙醇，搅拌0.证，析出L-鸟氨酸硝酸盐，过滤、干燥即得产品。实施例6一种酶转化生产L-鸟氨酸硝酸盐的方法，该方法包括如下步骤(1)固定化酶的制备取三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂，用摩尔浓度为5M碳酸钾溶液浸泡18h、过滤，滤干后加入摩尔浓度为5M碳酸钾溶液和质量浓度为4g/ml溴化钾溶液，于冰浴中反应60min，采用摩尔浓度为2M冷碳酸氢钠溶液调节pH值至10，再加入质量浓度为4g/l的精氨酸酶溶液，于10°C反应48h，再依次用0. 3M碳酸氢钠400ml、4M氯化钠400ml、去离子水洗涤400ml， 最后用饱和食盐水浸泡池，饱和食盐水的加入量以能浸没固定化酶为准，再洗净至检测不出氯离子即制得固定化酶，保存于水中；所述的三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂与碳酸钾、溴化钾、精氨酸酶的质量比为1 1.4 1.4 0.01 ；(2) L-鸟氨酸硝酸盐的制备将步骤(1)中制得的固定化酶与精氨酸、乙酸锰按质量比1 3 0.008混合，溶于去离子水中，采用硝酸调节PH值至6，在50°C下，搅拌反应他，搅拌速度为200rpm，过滤；(3) L-鸟氨酸硝酸盐的分离纯化在步骤( 过滤得到的滤液中加入活性炭，活性炭的加入量为6g/100ml滤液，用硝酸调节PH值至5. 5，于90°C下搅拌反应5min后，过滤，将滤出液浓缩至有结晶析出，停止浓缩，加入乙醇，搅拌池，析出L-鸟氨酸硝酸盐，过滤、干燥即得产品。实施例7一种酶转化生产L-鸟氨酸硝酸盐的方法，该方法包括如下步骤(1)固定化酶的制备取三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂，用摩尔浓度为2M碳酸钾溶液浸泡10h、过滤，滤干后加入摩尔浓度为2M碳酸钾溶液和质量浓度为2g/ml溴化钾溶液，于冰浴中反应20min，采用摩尔浓度为0. IM冷碳酸氢钠溶液调节pH值至80，再加入质量浓度为2g/l的精氨酸酶溶液，于5°C反应Mh，再依次用0. IM碳酸氢钠200ml、IM氯化钠200ml、去离子水洗涤200ml， 最后用饱和食盐水浸泡lh，饱和食盐水的加入量以能浸没固定化酶为准，再洗净至检测不出氯离子即制得固定化酶，保存于水中；所述的三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂与碳酸钾、溴化钾、精氨酸酶的质量比为1 0.35 0.4 0.008;(2) L-鸟氨酸硝酸盐的制备将步骤(1)中制得的固定化酶与精氨酸、乙酸锰按质量比1 1.4 0.004混合， 溶于去离子水中，采用硝酸调节pH值至5，在30°C下，搅拌反应6h，搅拌速度为80rpm，过滤；(3) L-鸟氨酸硝酸盐的分离纯化在步骤( 过滤得到的滤液中加入活性炭，活性炭的加入量为3g/100ml滤液，用硝酸调节PH值至3，于50°C下搅拌反应IOmin后，过滤，将滤出液浓缩至有结晶析出，停止浓缩，加入乙醇，搅拌lh，析出L-鸟氨酸硝酸盐，过滤、干燥即得产品。实施例8一种酶转化生产L-鸟氨酸硝酸盐的方法，该方法包括如下步骤(1)固定化酶的制备取三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂，用摩尔浓度为3M碳酸钾溶液浸泡12h、过滤，滤干后加入摩尔浓度为3M碳酸钾溶液和质量浓度为3g/ml溴化钾溶液，于冰浴中反应30min， 采用摩尔浓度为IM冷碳酸氢钠溶液调节pH值至9，再加入质量浓度为3g/l的精氨酸酶溶液，于3°C反应36h，再依次用0. 2M碳酸氢钠300ml、2M氯化钠300ml、去离子水洗涤300ml， 最后用饱和食盐水浸泡池，饱和食盐水的加入量以能浸没固定化酶为准，再洗净至检测不出氯离子即制得固定化酶，保存于水中；所述的三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂与碳酸钾、溴化钾、精氨酸酶的质量比为1 0.55 1 0.01 ；(2) L-鸟氨酸硝酸盐的制备将步骤(1)中制得的固定化酶与精氨酸、乙酸锰按质量比1 1.6 0.006混合， 溶于去离子水中，采用硝酸调节pH值至5，在50°C下，搅拌反应10h，搅拌速度为200rpm，过滤；(3) L-鸟氨酸硝酸盐的分离纯化在步骤( 过滤得到的滤液中加入活性炭，活性炭的加入量为5g/100ml滤液，用硝酸调节PH值至5.5，于90°C下搅拌反应30min后，过滤，将滤出液浓缩至有结晶析出，停止浓缩，加入乙醇，搅拌池，析出L-鸟氨酸硝酸盐，过滤、干燥即得产品。
权利要求
1.一种酶转化生产L-鸟氨酸硝酸盐的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤(1)固定化酶的制备取三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂，用碳酸钾溶液浸泡6-18h、过滤，滤干后加入碳酸钾溶液和溴化钾溶液，于冰浴中反应5-60min，采用冷碳酸氢钠溶液调节pH值至7_10，再加入精氨酸酶溶液，于1-10°C反应12-48h，再依次用碳酸氢钠、氯化钠、去离子水洗涤，最后用饱和食盐水浸泡0. 5-3h，再洗净即制得固定化酶，保存于水中；所述的三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂与碳酸钾、溴化钾、精氨酸酶的质量比为1 (0.3-1.4) (0.1-1.4) (0. 001-0.01) (2)L-鸟氨酸硝酸盐的制备将步骤(1)中制得的固定化酶与精氨酸、乙酸锰按质量比1 (1-3) (0. 002-0. 008) 混合，溶于去离子水中，采用硝酸调节PH值至5-6，在30-50°C下，搅拌反应6_10h，过滤；(3)L-鸟氨酸硝酸盐的分离纯化在步骤(2)过滤得到的滤液中加入活性炭，用硝酸调节pH值至2-5. 5，于40-90°C下搅拌反应5-30min后，过滤，将滤出液浓缩至有结晶析出，停止浓缩，加入乙醇，搅拌0. 5_3h， 析出L-鸟氨酸硝酸盐，过滤、干燥即得产品。
2.根据权利要求1所述的一种酶转化生产L-鸟氨酸硝酸盐的方法，其特征在于，步骤 (1)所述的三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂与碳酸钾、溴化钾、精氨酸酶的质量比为1 (0.35-0. 55) (0. 4-1) (0. 008-0. 01)。
3.根据权利要求1所述的一种酶转化生产L-鸟氨酸硝酸盐的方法，其特征在于，步骤 (1)所述的碳酸钾溶液的摩尔浓度为1-5M，溴化钾是质量浓度为l-4g/ml的溶液，所述的精氨酸酶是质量浓度为l_4g/l的溶液，所述的冷碳酸氢钠溶液的摩尔浓度为0. 05-2M。
4.根据权利要求1所述的一种酶转化生产L-鸟氨酸硝酸盐的方法，其特征在于，步骤 (1)所述的洗涤是依次利用0. 05-0. 3M的碳酸氢钠溶液，0. 5-4M的氯化钠溶液和去离子水各洗涤2-5次，每次用量为100-400ml。
5.根据权利要求1所述的一种酶转化生产L-鸟氨酸硝酸盐的方法，其特征在于，步骤(1)所述的饱和食盐水的加入量以能浸没固定化酶为准。
6.根据权利要求1所述的一种酶转化生产L-鸟氨酸硝酸盐的方法，其特征在于，步骤(2)所述的固定化酶与精氨酸、乙酸锰按质量比1 (1.4-1.6) (0.004-0.006)。
7.根据权利要求1所述的一种酶转化生产L-鸟氨酸硝酸盐的方法，其特征在于，步骤 (2)所述的硝酸的加入量根据pH值确定。
8.根据权利要求1所述的一种酶转化生产L-鸟氨酸硝酸盐的方法，其特征在于，步骤 (2)所述的搅拌反应的搅拌速度为60-200rpm。
9.根据权利要求1所述的一种酶转化生产L-鸟氨酸硝酸盐的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中活性炭的加入量为l_6g/100ml滤液。
全文摘要
本发明涉及一种酶转化生产L-鸟氨酸硝酸盐的方法，该方法包括如下步骤(1)固定化酶的制备；(2)L-鸟氨酸硝酸盐的制备；(3)L-鸟氨酸硝酸盐的分离纯化。与现有技术相比，本发明具有成本低、收率高、产品质量高、可工业化生产等优点。
文档编号C12P13/10GK102277395SQ20111022485
公开日2011年12月14日 申请日期2011年8月5日 优先权日2011年8月5日
发明者苏建勇, 郑南华, 陈雷 申请人:上海汉飞生化科技有限公司