专利名称：固定化细胞酶法制备l－鸟氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及利用固定化微生物细胞制备L-鸟氨酸的方法，更具体的说本发明涉及将含精氨酸脱亚氨酶和鸟氨酸氨甲酰转移酶的细胞固定化，通过上述固定化细胞内酶的作用将底物L-精氨酸转化为L-鸟氨酸。属酶工程技术领域。
二、技术背景人体中蛋白质的主要代谢产物是尿素。肝脏中含有精氨酸酶，可以水解L-精氨酸产生L-鸟氨酸与尿素。L-鸟氨酸也是生物合成L-精氨酸的前体，L-精氨酸能参与蛋白质的组成。L-鸟氨酸在人体中起着非同寻常的作用，尿素的形成必须有L-鸟氨酸的参与。L-鸟氨酸的缺乏可能会给生命带来危险。L-鸟氨酸可用于肝中毒的治疗(GB1020492，1966)。L-鸟氨酸作为解毒剂通过鸟氨酸循环将血氨排出体外。将L-鸟氨酸与ATP结合后其解氨毒的能力会得到极大的提高(GB1083911，1967)。加入适量L-鸟氨酸的蛇麻草可用于美容、丰胸，也可用于防治良性的囊肿和恶性肿瘤(CA2404275，2001)。如果定期服用按一定比例配制的L-精氨酸与L-鸟氨酸混合物，会有良好的减肥效果(GB2199243，1988)。L-鸟氨酸衍生物还可以用于抑郁症、乏力和神经紧张等疾病的治疗(GB1385562，1975)。α-二氟甲基-L-鸟氨酸治疗牛皮癣、前列腺肥大和肿瘤的疗效也非常好(JP2188558，1990)。
根据现有的文献报道，L-鸟氨酸生产工艺主要有以下三种1化学法目前工业上最常用的生产方法是采用化学法碱水解L-精氨酸制备L-鸟氨酸，1966年Shell Int.Rearsch采用丙烯酸和氰化钠作为主要原料化学合成DL-鸟氨酸。(GB1020492，1966)。
2发酵法用肠杆菌中的某些菌如Escherichia coli，Aerobacter aerogenes，Proteus rettgeri和Proteus mirabili的突变菌株，进行发酵生产L-鸟氨酸，发酵液中L-鸟氨酸最高为15mg/mL(GB1098348，1968；US3668072，1972)，Nakazawa等采用Corynebacterium属的某些种如C.glutamicum AJ11589、C.glutamicum ATCC13032和C.acetoacidophilum ATCC13870发酵生产L-鸟氨酸(JP57016696，1982)。Shibuya等利用Arthrobacter citreus 23-2A的突变株发酵生产L-鸟氨酸，发酵72h产率为35.2g/L。Shigezo等用Micrococcusglutamicus ATCC No.13232发酵生产L-鸟氨酸，发酵72h单位产量为26.2g/L，实得L-鸟氨酸盐酸盐结晶18g/L(US2988489，1961)。Brevibacteriumlactofermentum AJ-11678(Yoshimura，et al.，JP57166988，1982)也可用于L-鸟氨酸的发酵生产。1999年陈宁等报道利用谷氨酸棒杆菌突变株发酵生产L-鸟氨酸，产量为9.85g/L(天津轻工业学院学报，2000，320-24)。
3酶法1981年，沈淑英等用粪链球菌ATCC8043，粪产碱杆菌ATCC21400，粪链球菌S-43游离细胞转化底物L-精氨酸制备L-鸟氨酸，转化率为95-100％，提取收率为85-90％(天津微生物，1981，328-38)。1995年，M Kyriakos等利用从动物肝脏中提取的精氨酸酶水解L-精氨酸用于多种L-鸟氨酸盐的制备(US5405761，1995)。
上述L-鸟氨酸酶法生产过程都是利用游离细胞转化底物L-精氨酸，所以转化液中会含有少量菌体蛋白和其它杂质，不利于产物的分离纯化；且转化后要去除菌体，降低产物得率，导致生产成本增加。游离细胞转化且不利于工业化连续生产，所以酶的利用率也不高。
到目前为止，有关固定化细胞酶法制备L-鸟氨酸的方法未见报道。
发明内容
1.发明目的本发明的目的在于提供一种固定化微生物细胞酶法制备L-鸟氨酸的方法。
2.技术方案(1)菌种在本发明中，用于L-鸟氨酸生产的菌种有粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、解蛋白弧菌(Vibrio proteolyticus)、中间气单胞菌(Aeromonasmedia)、栖息微球菌(Micrococcus sedentarius)、格氏沙雷氏菌(Serratiagrimesii)和阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)等。
(2)培养基及培养条件
①种子培养种子培养基(1000mL)葡萄糖10-30g，牛肉膏5-10g，蛋白胨10-20g，磷酸二氢钾1-5g，硫酸镁0.2-1.0g，西红柿汁10-100mL，pH6.5-7.5，121℃灭菌20min。
种子培养时装液量为50-100mL/250mL三角瓶，接种量为一根长满的试管斜面，培养温度为30-37℃，摇床转速为100-200r/min。
②发酵培养发酵培养基(1000mL)酵母膏5-20g，葡萄糖10-20g，蛋白胨5-20g，玉米浆5-10g，磷酸二氢钾1.0-2.0g，硫酸镁0.5-1.0g，pH7.0-7.5。121℃灭菌20min。
发酵培养时装液量为50-150mL/250mL三角瓶，接种量为2％-10％，培养温度为25-37℃，摇床转速为100-200rpm。
(3)一种固定化细胞酶法制备L-鸟氨酸的方法，其特征步骤如下①菌种活化取经冷冻干燥保藏的菌种用适量的无菌液体种子培养基溶解，然后接入液体种子培养基中恒温培养，然后取上述种子接入新鲜的种子培养基继续活化；②菌种发酵和菌体细胞收集将上述菌种接到发酵培养基中，培养在通气条件下进行，可以在发酵过程中通过加酸对发酵液进行pH调节，以利于菌体生长，提高菌体产量；将适龄的发酵液离心收集菌体；③细胞固定化将所收集的菌体细胞和一定量的包埋剂混合均匀，加入成型剂中固化成型，还可加强化剂进行强化处理，即得固定化细胞；④L-精氨酸的转化将上述固定化处理后的含菌体细胞胶体装柱，将L-精氨酸溶液流经凝胶柱进行生物转化，收集流出的转化液，转化液可重复上柱，直到底物L-精氨酸被完全转化成L-鸟氨酸；⑤L-鸟氨酸的分离纯化将上述转化液用活性炭脱色去除杂质后，浓缩至合适浓度，结晶，母液可以与下一次转化液合并浓缩，再结晶，多次重复后母液中L-鸟氨酸可以用阳离子交换柱分离得到，结晶粗品可以通过重结晶进行精制，通过离子交换柱制得的L-鸟氨酸同样需要进一步精制。精制的方法可以为重结晶，或用乙醇沉淀等。
上述步骤①中所述的菌种包括粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、解蛋白弧菌(Vibrio proteolyticus)、中间气单胞菌(Aeromonas media)、栖息微球菌(Micrococcus sedentarius)、格氏沙雷氏菌(Serratia grimesii)和阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)等。
上述步骤③中所述的包埋剂包括海藻酸钠、卡拉胶、聚乙烯醇、明胶和甲壳素等；成型剂包括氯化钙、氯化钾、硼酸溶液和磷酸钠溶液等；强化剂包括戊二醛等。
上述步骤③中所述的包埋剂海藻酸钠和卡拉胶的浓度均为1-5％，菌体细胞的量为1-20％，成型剂氯化钙或氯化钾的浓度为1-5％，固化时间为1-3h，固化温度为20-40℃；用包埋剂聚乙烯醇浓度为5-20％和卡拉胶浓度为0.3-1.2％的混合液，菌体细胞的量为1-20％，成型剂为pH5-8的氯化钾-硼酸饱和溶液，固化温度为10-50℃，固化时间为20-50h；用包埋剂明胶的浓度为5-20％，菌体细胞的量为1-20％，固化温度为4-10℃。胶体强化剂戊二醛的浓度为0.5-3％，强化处理时间为5-120min；用包埋剂甲壳素的浓度为1-10％，菌体细胞的量为1-20％，成型剂磷酸钠缓冲溶液的pH为4-9，固化温度为10-50℃，固化时间为12-48h，。
上述步骤④中所述的L-精氨酸浓度为0.1-20％，流经酶转化柱的速度为10-1000mL/h，转化温度为25-45℃。
3.有益效果采用固定化细胞的方法，可以简便的收集转化液进行产物制备，简化了工艺过程，提高了酶的利用率，底物L-精氨酸转化率在95％以上，产品得率高于80％，且有利于工业化生产过程中的自动控制。
具体实施例方式
实施例1 种子培养和发酵培养一种种子培养基葡萄糖15g，牛肉膏7.5g，蛋白胨15g，磷酸二氢钾3.5g，硫酸镁0.5g，西红柿汁100mL，水900mL，pH7.5，121℃灭菌20分钟。
一种发酵培养基如下葡萄糖2.0g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.7g，玉米浆0.8g，磷酸二氢钾0.1g，硫酸镁0.06g，L-精氨酸0.3g，水100mL，pH7.2。
用适量的灭菌过的种子培养基将冻干的中间气单胞菌菌种溶化，然后接入装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，于37℃恒温培养，摇床转速为200r/min。24hrs后取上述种子10mL接入新鲜的种子培养基继续活化。
取4mL上述活化好的菌种接入100mL发酵培养基中，200rpm下37℃恒温培养24h。
实施例2 固定化细胞酶法制备L-鸟氨酸的方法如实施例1所述发酵培养1000mL中间气单胞菌，6000rpm离心20min收集菌体，得湿菌体12.5g。洗入1200mL固定剂(3％海藻酸钠溶液)中，混匀。然后用注射器将含有菌体的海藻酸钠溶液快速滴入3000mL成型剂(2％CaCl2溶液)中，固化1hr后除去成型剂，并用5000mL生理盐水洗涤3次。将所得的胶粒装入直径5cm，高50cm的玻璃柱中。1000mL 5％L-精氨酸溶液以20mL/h流经胶柱，转化完全后，收集流出液并减压浓缩至200mL，用2g活性炭脱色处理。脱色液继续减压浓缩至100mL，加入200mL 95％乙醇搅拌均匀，冷却结晶，真空过滤得晶体干重35.5g。[α]D20＝+11.0(C＝5.5，H2O)。结晶母液收集与下次转化液合并处理。
实施例3 固定化细胞酶法制备L-鸟氨酸的方法如例1的所示的培养方法发酵培养粪肠球菌1000mL，离心收集菌体，离心机转速为6000rpm，20min。称菌体湿重10.2g，悬浮在50mL生理盐水中，37℃水浴保温。取10g聚乙烯醇(PVA)，加入50mL蒸馏水浸泡1d，加入0.5g卡拉胶，混匀后置高压锅中于110℃保温20min，使PVA充分溶化，取出置45℃水浴保温。然后将细胞悬浮液与等量的PVA-卡拉胶混合液混合，用针管滴入pH6.4的KCl-饱和硼酸溶液中，4℃下静置30h，制得粪肠球菌的固定化细胞胶粒。将所得胶粒装入直径5cm，高50cm的玻璃柱中。1000mL 5％L-精氨酸溶液以15mL/h流经胶柱，转化完全后，收集流出液并减压浓缩至200mL，用2g活性炭脱色处理。脱色液继续减压浓缩至100mL，加入200mL 95％乙醇搅拌均匀，冷却结晶，真空过滤得晶体干重32.5g。[α]D20＝+11.0(C＝5.5，H2O)。
实施例4 固定化细胞酶法制备L-鸟氨酸的方法如实施例1所示方法发酵培养解蛋白弧菌100mL，得湿菌体1.2g，洗入120mL固定剂(3％卡拉胶溶液)中，混匀。然后用注射器将含有菌体的卡拉胶溶液快速滴入300mL成型剂(2％KCl溶液)中，固化2hr后除去成型剂，并用500mL生理盐水洗涤3次。将所得的胶粒装入直径3cm，高20cm的玻璃柱中。1000mL的5％L-精氨酸溶液以10mL/h流经胶柱，转化完全后，收集流出液并减压浓缩至200mL，用2g活性炭脱色处理。脱色液继续减压浓缩至100mL，加入200mL 95％乙醇搅拌均匀，冷却结晶，真空过滤得晶体干重34.2g。[α]D20＝+11.2(C＝5.5，H2O)。
实施例5 固定化细胞酶法制备L-鸟氨酸的方法如实施例1所述发酵培养1000mL栖息微球菌，6000rpm离心20min收集菌体，得湿菌体12g。洗入1000mL的2％固定剂甲壳素溶液中，混匀。然后滴入1000mL的pH7.0的磷酸钠缓冲溶液中固化24h。将所得的胶粒装入直径5cm，高50cm的玻璃柱中。1000mL 5％L-精氨酸溶液以20mL/h流经胶柱，转化完全后，收集流出液并减压浓缩至200mL，用2g活性炭脱色处理。脱色液继续减压浓缩至100mL，加入200mL 95％乙醇搅拌均匀，冷却结晶，真空过滤得晶体干重35.5g。[α]D20＝+11.0(C＝5.5，H2O)。结晶母液收集与下次转化液合并处理。
实施例6 固定化细胞酶法制备L-鸟氨酸的方法如实施例1所述发酵培养1000mL格氏沙雷氏菌，6000rpm离心20min收集菌体，得湿菌体10.5g。洗入1000mL固定剂(3％明胶溶液)中，混匀。然后置于4℃低温凝固，固化2hr后将胶块切成5mm*5mm的胶粒，并用5000mL的1％的戊二醛强化1hr。将所得的胶粒装入直径5cm，高50cm的玻璃柱中。1000mL的5％L-精氨酸溶液以20mL/h流经胶柱，转化完全后，收集流出液并减压浓缩至200mL，用2g活性炭脱色处理。脱色液继续减压浓缩至100mL，加入200mL 95％乙醇搅拌均匀，冷却结晶，真空过滤得晶体干重37.5g。[α]D20＝+10.8(C＝5.5，H2O)。结晶母液收集与下次转化液合并处理。
权利要求
1.一种用固定化细胞酶法制备L-鸟氨酸的方法，其制备步骤如下①菌种活化；取经冷冻干燥保藏的菌种用无菌液体种子培养基溶解，然后接入液体种子培养基中，恒温培养，然后取上述种子接入新鲜的种子培养基继续活化；②菌种发酵和菌体细胞收集；将上述菌种接到发酵培养基中，在通气条件下培养，然后将适龄的发酵液离心收集菌体；③细胞固定化；将所收集的菌体细胞和包埋剂混合均匀，加入成型剂中固化成型，还可加入强化剂进行强化处理，即得固定化细胞；④L-精氨酸转化；将上述固定化处理后含菌体细胞的胶体装柱，将L-精氨酸溶液流经凝胶柱进行生物转化，收集流出的转化液，转化液可重复上柱，直到底物L-精氨酸被完全转化成L-鸟氨酸；⑤L-鸟氨酸分离纯化；将上述转化液用活性炭脱色去除杂质后，浓缩至结晶，母液中L-鸟氨酸采用阳离子交换柱分离；粗品通过重结晶进行精制。
2.根据权利要求1所述的固定化细胞酶法制备L-鸟氨酸的方法，其特征在于在步骤①中所述的菌种包括粪肠球菌、解蛋白弧菌、中间气单胞菌、栖息微球菌、格氏沙雷氏菌和阪崎肠杆菌。
3.根据权利要求1所述的固定化细胞酶法制备L-鸟氨酸的方法，其特征在于在步骤③中所述的包埋剂包括海藻酸钠、卡拉胶、聚乙烯醇、明胶和甲壳素。
4.根据权利要求1所述的固定化细胞酶法制备L-鸟氨酸的方法，其特征在于在步骤③中所述的成型剂包括氯化钙、氯化钾、硼酸溶液和磷酸钠溶液。
5.根据权利要求1所述的固定化细胞酶法制备L-鸟氨酸的方法，其特征在于在步骤③中所述的强化剂为戊二醛。
6.根据权利要求1所述的固定化细胞酶法制备L-鸟氨酸的方法，其特征在于在步骤③中所述的包埋剂海藻酸钠和卡拉胶的浓度均为1-5％，菌体细胞的量为1-20％，成型剂氯化钙或氯化钾的浓度为1-5％，固化时间为1-3h，固化温度为20-40℃。
7.根据权利要求1所述的固定化细胞酶法制备L-鸟氨酸的方法，其特征在于在步骤③中所述的包埋剂聚乙烯醇浓度为5-20％和卡拉胶浓度为0.3-1.2％的混合液，菌体细胞的量为1-20％，成型剂为pH5-8的氯化钾-硼酸饱和溶液，固化温度为10-50℃，固化时间为20-50h。
8.根据权利要求1所述的固定化细胞酶法制备L-鸟氨酸的方法，其特征在于步骤③中所述的包埋剂明胶浓度为5-20％，菌体细胞的量为1-20％，固化温度为4-10℃，胶体强化剂戊二醛的浓度为0.5-3％，强化处理时间为5-120min。
9.根据权利要求1所述的固定化细胞酶法制备L-鸟氨酸的方法，其特征在于步骤③中所述的包埋剂甲壳素浓度为1-10％，菌体细胞量为1-20％，成型剂磷酸钠缓冲溶液pH为4-9，固化温度为10-50℃，固化时间为12-48h，。
10.根据权利要求1所述的固定化细胞酶法制备L-鸟氨酸的方法，其特征在于步骤④中所述的中所述的L-精氨酸的浓度为0.1-20％流经酶转化柱的速度为10-1000mL/h，转化温度为25-45℃。
全文摘要
本发明是以L－精氨酸为原料的固定化细胞酶法制备L－鸟氨酸的方法。将发酵得到的微生物细胞用不同固定化载体包埋装柱，让底物L－精氨酸溶液以一定速度流经固定化细胞填充柱，收集流出液，浓缩结晶或用阳离子交换柱分离纯化得L－鸟氨酸。本发明可提高微生物细胞利用率，底物转化率95％以上，产品得率高于80％。
文档编号C12P13/00GK1661026SQ20041006604
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月15日 优先权日2004年12月15日
发明者焦庆才, 李加友, 曹瑜, 刘毅, 钱绍松, 陈群 申请人:南京大学