专利名称：一种制备天冬氨酸氨基转移酶的方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程和蛋白表达领域，涉及一种用生物工程技术高效制备天冬氨酸氨基转移酶的方法，产物可作为抗原物质进行动物免疫，筛选相关抗体，同时为临床化学诊断所需校准品、标准物质和参考品的制备开发奠定基础。
背景技术：
天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase AST),原名谷草转移酶(glutamic oxaloacetic transaminase GOT),是体内重要的转氨酶,在体内各组织中广泛存在，AST以心脏活性最高。正常人血清中含量甚微。正常情况下，血液中来自肝细胞的天冬氨酸氨基转移酶的范围是0-40U/L (单位)。当心肌细胞受到损伤，天冬氨酸氨基转移酶会大量释放到人体血液中，导致血液中天冬氨酸氨基转移酶升高；当肝细胞受到损伤时，同样会检测到血液中天冬氨酸氨基转 移酶的值升高。肝内的谷草转氨酶有2种同工酶，分别存在于肝细胞的线粒体(mAST)和胞浆内(sAST)。在肝细胞轻度病变时，仅sAST释放入血；而当病变严重时，mAST也会相继释放入血。故血清AST活性随肝细胞损害的程度增高。天冬氨酸氨基转移酶是肝功能检查里重要的一项，可以检验肝组织是否受损。在肝功能检查中，谷丙转氨酶是反映肝细胞受损的指标，而天冬氨酸氨基转移酶是反映肝细胞坏死的标准。对于肝硬化、肝纤维化、肝癌的检测非常准确。天冬氨酸氨基转移酶可以和谷丙转氨酶结合起来反映肝功能的状况，比如谷丙转氨酶/天冬氨酸氨基转移酶比值均在
I.O以下为肝硬化或早期肝硬化患者。我国幅员辽阔，人口众多，临床诊断试剂市场巨大，前景广阔。就国内的现状来说，我国的诊断试剂行业仍处于成长初期，即产品研发与生产的投入初期，成长期还没有真正到来，而我国诊断试剂市场规模约为全球市场的I / 14，有较大的成长空间。研制价廉物美的诊断试剂产品无疑是非常必要且具重要意义的。目前国外的产品通常是把试剂、参考品(校准品、质控品)、仪器作为一个系统(封闭系统)推入市场，在检测重复性、准确性上有很大的优势，并且具有市场垄断性。国内主要的诊断试剂生产厂家几乎都没有生产相应质控品的经验和实力，市场上认可的国产产品寥寥无几。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种操作简单、制备成本低廉，成功率高的制备天冬氨酸氨基转移酶的方法。为实现上述目的，本发明一种制备天冬氨酸氨基转移酶的方法，该方法包括I)改造全基因合成人源化天冬氨酸氨基转移酶编码基因序列，去除大肠杆菌稀有密码子；2)将步骤I)中改造后的天冬氨酸氨基转移酶编码基因序列插入表达载体中，并用大肠杆菌菌株转化表达；3)将转化表达菌株接种于LB培养基，IPTG诱导；4)所得菌体破菌，离心分离，过Ni-NTA柱纯化；其中，步骤I)中改造后的全基因合成人源化天冬氨酸氨基转移酶编码基因序列为
权利要求
1.一种制备天冬氨酸氨基转移酶的方法，其特征在于，该方法包括 1)改造全基因合成人源化天冬氨酸氨基转移酶编码基因序列，去除大肠杆菌稀有密码子; 2)将步骤I)中改造后的天冬氨酸氨基转移酶编码基因序列插入表达载体中，并用大肠杆菌菌株转化表达； 3)将转化表达菌株接种于LB培养基，IPTG诱导； 4)所得菌体破菌，离心分离，过Ni-NTA柱纯化； 其中，步骤I)中改造后的全基因合成人源化天冬氨酸氨基转移酶编码基因序列为
2.如权利要求I所述制备天冬氨酸氨基转移酶的方法，其特征在于，步骤 2)中所述表达载体为pRSF Duet, pET表达系列。
3.如权利要求I所述制备天冬氨酸氨基转移酶的方法，其特征在于，步骤2)中所述大肠杆菌菌株为BL21 (DE3)，Rosetta (DE3)。
4.如权利要求3所述制备天冬氨酸氨基转移酶的方法，其特征在于，所述BL21(DE3)菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体的基因。
5.如权利要求4所述制备天冬氨酸氨基转移酶的方法，其特征在于，\噬菌体DE3区含有17噬菌体RNA聚合酶，该区整合于BL21的染色体上形成所述BL21 (DE3)。
6.如权利要求I所述制备天冬氨酸氨基转移酶的方法，其特征在于，步骤4)中所述破菌方法为高压破碎、超声或者溶菌酶酶解。
7.—种如权利要求I所述制备天冬氨酸氨基转移酶的方法在校准品、标准物质和参考品制备中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述制备天冬氨酸氨基转移酶的纯品添加入人源或动物源的血清，配制成指定浓度的标准品或校准品。
9.一种利用权利要求I所述制备天冬氨酸氨基转移酶的方法制成的产物作为免疫用的抗原物质，来筛选相关抗体。
全文摘要
本发明公开了一种制备天冬氨酸氨基转移酶的方法及应用，该方法包括改造全基因合成人源化天冬氨酸氨基转移酶编码基因序列，去除大肠杆菌稀有密码子；将改造后的天冬氨酸氨基转移酶编码基因序列插入表达载体中，并用大肠杆菌菌株转化表达；将转化表达菌株接种于LB培养基，IPTG诱导；所得菌体破菌，离心分离，过Ni-NTA柱纯化；本发明制备天冬氨酸氨基转移酶操作非常简单，制备成本低，成品产率高，纯度高而且具有高生物活性，作为抗原物质可进行动物免疫，筛选相关抗体，同时为尽快建立国内临床化学诊断急需的校准品制备平台，研制诊断试剂标准物质和参考品奠定基础。
文档编号C12Q1/52GK102807988SQ20121029144
公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月15日 优先权日2012年8月15日
发明者肖飞, 黄薇, 王大光 申请人:北京翔达盛吉科技咨询有限公司