专利名称：酶转化生产l—鸟氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及L-鸟氨酸的制备方法。
背景技术：
目前，国内外对于酶法转化生产L-鸟氨酸的文献尚未见报道。L-鸟氨酸的制备方法主要有化学法和发酵法，其中化学法是以精氨酸为原料，经碱法水解或利用精氨酸酶水解得到L-鸟氨酸；而发酵法是利用微生物发酵生产L-鸟氨酸，常用于发酵生产L-鸟氨酸的微生物有谷氨酸棒杆菌、乳酸发酵短杆菌、大肠杆菌、解烃棒杆菌、洁白链霉菌等。由于化学法生产L-鸟氨酸条件苛刻，大量使用有机溶剂，给环境带来严重污染；而发酵法生产L-鸟氨酸产量低(一般只有10g/L)，周期长，产物杂质多，分离困难；采用上述方法制备L-鸟氨酸产率不高，所以生产的L-鸟氨酸成本很高，给实际推广应用带来了很大困难。
发明内容
本发明的目的在于提供一种L-鸟氨酸的制备方法，该制备方法通过对粪肠球菌进行筛选、诱变获得一株L-鸟氨酸产率很高、专一性强的菌株粪肠球菌CGMCC NO.1786，选用合适的培养基在最适培养条件下培养一定时间，加入精氨酸，在最佳转化条件下酶转化生产L-鸟氨酸，转化液通过离子交换树脂柱的分离、纯化后，可得到高纯度的L-鸟氨酸。该方法具有生产条件温和、生产周期短、产品纯度高、产量高、生产成本低等优点。
本发明的整体技术构思是发酵法生产L-鸟氨酸，该方法由下列工艺步骤组成(1)将粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1786菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；(2)将斜面菌株扩大培养作为种子液；(3)将种子液接入发酵罐中进行发酵；(4)加入精氨酸作为底物进行转化；(5)L-鸟氨酸的分离纯化。
本发明的具体工艺步骤及工艺条件是
步骤(1)中斜面培养基由下列重量份组分组成葡萄糖5-10份、尿素10-20份、玉米浆2.0-3.5份、硫酸镁1.0份、磷酸氢二钾1.0份、氯化钠5.0份、碳酸钙2.0份、硫酸铁0.02份、硫酸锰0.02份，琼脂15-20份和水1000份；制备斜面菌种的工艺条件为pH值为7.0-8.0、温度25-35℃、培养时间为24-48小时。
步骤(2)中种子液和步骤(3)中发酵液由下列重量份组分组成葡萄糖40-60份、尿素10-20份、玉米浆2.0-3.5份，硫酸镁0.5-1.0份、磷酸氢二钾1.0份、氯化钠5.0份、碳酸钙2.0份、硫酸铁0.02份、硫酸锰0.02份和水1000份；发酵的工艺条件为发酵液接种量为10-15％，pH值为6.0-7.5，培养温度为25-35℃，通风量为0.5-1.0vvm，搅拌转速为120-160转/分钟，发酵时间为24-36小时。
步骤(4)中转化条件为底物精氨酸质量浓度为120-150g/l，转化温度为30-55℃，转化时间为36-72小时，搅拌转速为80-120转/分钟。在此转化条件下，精氨酸转化为L-鸟氨酸的转化率达95-99.5％，每升发酵液中含L-鸟氨酸90-112g。
步骤(5)中α-熊果苷的分离纯化包括以下四个步骤a、将发酵完成后的发酵液在4000转/分钟条件下离心20分钟；b、把经过a步骤后的发酵液通过弱酸性阳离子交换树脂柱除去阳离子杂质，弱酸性阳离子交换树脂柱为724型树脂柱；c、把经过b步骤的发酵液通过磺酸型阳离子交换树脂柱进一步进行分离纯化，磺酸型阳离子交换树脂柱为D001树脂柱；d、把经过c步骤的发酵液真空浓缩、结晶，即可得到纯度为99％以上的L-鸟氨酸，真空干燥真空度为0.1Mpa，温度为60度，干燥后的成品为白色粉末状。
本发明所用的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1786已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为粪肠球菌CGMCC NO.1786，保藏时间为2006年8月28日。
粪肠球菌CGMCC NO.1786的筛选，由下列工艺步骤组成(1)将安培管粪肠球菌菌种接种斜面制得斜面菌种；(2)将复壮后菌种涂布平板；(3)将平板菌落接种摇瓶发酵培养，进行初筛和复筛；(4)将复筛后的菌株进行复合诱变。
步骤(1)中斜面培养基和步骤(2)中的平板培养基由下列重量份组分组成葡萄糖5-10份、尿素10-20份、玉米浆2.0-3.5份、硫酸镁1.0份、磷酸氢二钾1.0份、氯化钠5.0份、碳酸钙2.0份、硫酸铁0.02份、硫酸锰0.02份，琼脂15-20份和水1000份；制备斜面菌种和平板的工艺条件为pH值为7.0-8.0、温度25-35℃、培养时间为24-48小时。
步骤(3)中发酵液由下列重量份组分组成葡萄糖40-60份、尿素10-20份、玉米浆2.0-3.5份，硫酸镁0.5-1.0份、磷酸氢二钾1.0份、氯化钠5.0份、碳酸钙2.0份、硫酸铁0.02份、硫酸锰0.02份和水1000份；发酵的工艺条件为pH值为7.0-7.5，培养温度为25-35℃，搅拌转速为120-160转/分钟，发酵时间为24-36小时。
步骤(4)中诱变依次包括种子菌悬液的制备，诱变剂的加入量，紫外照射时。
将斜面菌种接种到含5ml生理盐水试管中，往试管中加入体积百分比为0.5％-2.0％的硫酸二乙酯诱变剂，在漩涡振荡器上振荡1-2min，取0.5ml该菌悬液涂布平板，把平板放在紫外灯照射20-60s，然后把平板暗培养。培养条件为培养温度25-35℃、培养时间为48-72小时。
最后，得到粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1786。
本发明所取得的技术进步在于本发明是粪肠球菌CGMCC NO.1786酶法生产L-鸟氨酸，具有生产成本低，生产条件温和，转化体系中杂质较少，工艺步骤简单，生产操作安全等优点。采用本发明生产L-鸟氨酸产量高，每升发酵液中含有90-112g L-鸟氨酸，精氨酸转化率可达99.5％。通过离子交换树脂分离纯化，纯度可达到99.5％以上，具有重大工业化意义。
实施例以下结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1(1)菌种斜面培养将粪肠球菌CGMCC NO.1786菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；其中菌种斜面培养基由下列重量份组分组成葡萄糖5份、尿素20份、玉米浆3.5份、硫酸镁1.0份、磷酸氢二钾1.0份、氯化钠5.0份、碳酸钙2.0份、硫酸铁0.02份、硫酸锰0.02份，琼脂15份和水1000份；制备斜面菌种的工艺条件为pH值为7.5、温度30℃、培养时间为24小时。
(2)接种发酵将斜面菌株扩大培养作为种子液；将种子液按10％的接种量接入发酵罐中进行发酵；其中种子液和发酵液由下列重量份组分组成葡萄糖60份、尿素15份、玉米浆3.0份，硫酸镁0.5份、磷酸氢二钾1.0份、氯化钠5.0份、碳酸钙2.0份、硫酸铁0.02份、硫酸锰0.02份和水1000份；发酵的工艺条件为发酵液接种量为10％，pH值为6.0，培养温度为30℃，通风量为0.8vvm，搅拌转速为160转/分钟，发酵时间为36小时。
(3)生产L-鸟氨酸加入底物质量浓度为150g/l；其中转化条件为转化温度为35℃，转化时间为48小时，搅拌转速为100转/分钟。在此转化条件下，精氨酸转化为L-鸟氨酸的转化率达99.5％，每升发酵液中含L-鸟氨酸112g。
(4)L-鸟氨酸的分离纯化，包括以下四个步骤a、将发酵完成后的发酵液在4000转/分钟条件下离心20分钟；b、步把经过a步骤后的发酵液通过724型弱酸性阳离子交换树脂柱除去NH4+、K+、Mg2+等阳离子杂质；c、把经过b步骤的发酵液通过D001磺酸型阳离子交换树脂柱进一步进行分离纯化；d、步骤中的真空干燥真空度为0.1Mpa，温度为60℃，干燥后的成品为白色粉末状，纯度达99.5％。
实施例2(1)菌种斜面培养将粪肠球菌CGMCC NO.1786菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；其中菌种斜面培养基由下列重量份组分组成葡萄糖8份、尿素15份、玉米浆3.0份、硫酸镁1.0份、磷酸氢二钾1.0份、氯化钠5.0份、碳酸钙2.0份、硫酸铁0.02份、硫酸锰0.02份，琼脂15份和水1000份；制备斜面菌种的工艺条件为pH值为8.0、温度40℃、培养时间为36小时。
(2)接种发酵将斜面菌株扩大培养作为种子液；
将种子液按10％的接种量接入发酵罐中进行发酵；其中种子液和发酵液由下列重量份组分组成葡萄糖50份、尿素20份、玉米浆3.5份，硫酸镁0.5份、磷酸氢二钾1.0份、氯化钠5.0份、碳酸钙2.0份、硫酸铁0.02份、硫酸锰0.02份和水1000份；发酵的工艺条件为发酵液接种量为10％，pH值为6.5，培养温度为37℃，通风量为1.0vvm，搅拌转速为140转/分钟，发酵时间为36小时。
(3)生产L-鸟氨酸加入底物质量浓度为135g/l；其中转化条件为转化温度为44℃，反应时间为48小时，搅拌转速为100转/分钟。在此转化条件下，精氨酸转化为L-鸟氨酸的转化率达95.0％，每升发酵液中含L-鸟氨酸96.2g。
(4)L-鸟氨酸的分离纯化，包括以下四个步骤a、将发酵完成后的发酵液在4000转/分钟条件下离心20分钟；b、步把经过a步骤后的发酵液通过724型弱酸性阳离子交换树脂柱除去NH4+、K+、Mg2+等阳离子杂质；c、把经过b步骤的发酵液通过D001磺酸型阳离子交换树脂柱进一步进行分离纯化；d、步骤中的真空干燥真空度为0.1Mpa，温度为60℃，干燥后的成品为白色粉末状，纯度达99.5％。
实施例3(1)菌种斜面培养将粪肠球菌CGMCC NO.1786菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；其中菌种斜面培养基由下列重量份组分组成葡萄糖10份、尿素10份、玉米浆2.5份、硫酸镁1.0份、磷酸氢二钾1.0份、氯化钠5.0份、碳酸钙2.0份、硫酸铁0.02份、硫酸锰0.02份，琼脂15份和水1000份；制备斜面菌种的工艺条件为pH值为7.0、温度30℃、培养时间为48小时。
(2)接种发酵将斜面菌株扩大培养作为种子液；将种子液按15％的接种量接入发酵罐中进行发酵；其中种子液和发酵液由下列重量份组分组成葡萄糖45份、尿素20份、玉米浆3.0份，硫酸镁0.5份、磷酸氢二钾1.0份、氯化钠5.0份、碳酸钙2.0份、硫酸铁0.02份、硫酸锰0.02份和水1000份；
发酵的工艺条件为发酵液接种量为10％，pH值为6.0，培养温度为30℃，通风量为0.8vvm，搅拌转速为160转/分钟，发酵时间为36小时。
(3)生产L-鸟氨酸加入底物质量浓度为125g/l；其中转化条件为转化温度为50℃，反应时间为48小时，搅拌转速为100转/分钟。在此转化条件下，精氨酸转化为L-鸟氨酸的转化率达98.5％，每升发酵液中含L-鸟氨酸92.4g。
(4)L-鸟氨酸的分离纯化，包括以下四个步骤a、将发酵完成后的发酵液在4000转/分钟条件下离心20分钟；b、步把经过a步骤后的发酵液通过724型弱酸性阳离子交换树脂柱除去NH4+、K+、Mg2+等阳离子杂质；c、把经过b步骤的发酵液通过D001磺酸型阳离子交换树脂柱进一步进行分离纯化；d、步骤中的真空干燥真空度为0.1Mpa，温度为60℃，干燥后的成品为白色粉末状，纯度达99.5％。
权利要求
1.酶转化生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于所述的粪肠球菌酶转化生产L-鸟氨酸，生产过程由下列工艺步骤组成(1)将粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1786菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；(2)将斜面菌种扩大培养作为种子液；(3)将种子液接入发酵罐中进行发酵，其发酵条件为发酵液接种量为10-15％，pH值为6.0-7.5，培养温度为25-35℃，通风量为0.5-1.0vvm，搅拌转速为120-160转/分钟，发酵时间为24-36小时；(4)加入精氨酸作为底物进行转化，其转化条件为底物精氨酸质量浓度为120-150g/l，转化温度为30-55℃，转化时间为36-72小时，搅拌转速为80-120转/分钟。在此转化条件下，精氨酸转化为L-鸟氨酸的转化率达95-99.5％，每升发酵液中含L-鸟氨酸90-112g；(5)L-鸟氨酸的分离纯化。
2.根据权利要求1所述的酶转化生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于所述的(1)步骤中的斜面培养基由下列重量份组分组成葡萄糖5-10份、尿素10-20份、玉米浆2.0-3.5份、硫酸镁1.0份、磷酸氢二钾1.0份、氯化钠5.0份、碳酸钙2.0份、硫酸铁0.02份、硫酸锰0.02份，琼脂15-20份和水1000份。
3.根据权利要求1或2所述的酶转化生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于制备斜面菌种的工艺条件为pH值为7.0-8.0、温度25-35℃、培养时间为24-48小时。
4.根据权利要求1所述的酶转化生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于所述的(2)步骤中的种子液和(3)步骤中发酵液由下列重量份组分组成葡萄糖40-60份、尿素10-20份、玉米浆2.0-3.5份，硫酸镁0.5-1.0份、磷酸氢二钾1.0份、氯化钠5.0份、碳酸钙2.0份、硫酸铁0.02份、硫酸锰0.02份和水1000份。
5.根据权利要求1所述的酶转化生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于所述的(5)步骤中的L-鸟氨酸的分离纯化包括以下四个步骤a、将发酵完成后的发酵液离心除去菌体；b、把经过a步骤后的发酵液通过弱酸性阳离子交换树脂柱除去阳离子杂质；c、把经过b步骤的发酵液通过磺酸型阳离子交换树脂柱进一步进行分离纯化；d、把经过c步骤的发酵液真空浓缩、结晶，即可得到纯度为99.5％以上的L-鸟氨酸。
6.根据权利要求5所述的酶转化生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于所述的a步骤发酵液在4000转/分钟条件下离心20分钟；b步骤中的弱酸性阳离子交换树脂柱为724型树脂柱；c步骤中的磺酸型阳离子交换树脂柱为D001树脂柱；d步骤中的真空干燥真空度为0.1Mpa，温度为60度，干燥后的成品纯度达99.5％以上。
7.粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1786。
全文摘要
本发明涉及L－鸟氨酸的制备方法，它包括斜面种子的制备，培养基的选择，转化条件的优化和产物的提取等工艺步骤。本发明通过粪肠球菌酶转化生产L－鸟氨酸，具有生产成本低，生产条件温和，转化体系中杂质较少，工艺步骤简单，生产操作安全等优点。采用本发明生产L－鸟氨酸产量高，每升发酵液中含有90－112g L－鸟氨酸，精氨酸转化率可达99.5％。L－鸟氨酸是细胞中重要的代谢化合物，对于生物体内氨态氮的排出有重要调节作用；此外，L－鸟氨酸还是重要的医药工业基础原料。
文档编号C12R1/01GK1908177SQ20061011203
公开日2007年2月7日 申请日期2006年8月29日 优先权日2006年8月29日
发明者张鹏, 张淑荣, 刘春巧, 杨育红 申请人:张鹏, 张淑荣, 刘春巧