专利名称：一种新的脱氨基神经氨酸酶及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种新的脱氨基神经氨酸酶(deaminoneuraminidase)。本发明特别涉及一种无唾液酸酶(sialidase)活性的脱氨基神经氨酸酶。
背景技术：
脱氨基神经氨酸(deaminoneuraminic acid)(3-脱氧-D-甘油-D-半乳糖-nonulosonic acid或者2-酮-3-脱氧-D-甘油-D-半乳糖-nononic acid，下文中称做“KDN”)具有与唾液酸(sialic acid)相似的结构，仅在唾液酸5位碳上所连接的N-酰基被羟基取代。因此，迄今已发现KDN广泛地存在于生物界，是复合多糖的一种组份，并具有多种多样的存在形式，这点与唾液酸一致。另一方面，KDN具有与唾液酸不同的特性，例如，现已阐明含有KDN的复合多糖在受精过程中卵子和精子的相互作用中起着重要的作用。人们对于含有KDN的糖蛋白和糖脂结构和功能的解析产生了极大的兴趣。
另外，那些已知的可裂解含KDN复合多糖中KDN酮苷键(ketosidiclinkage)的酶(脱氨基神经氨酸酶，deaminoneuraminidase，如果需要的话在下文中称为KDNase)，其中包括存在于泥鳅肝脏中的KDN-唾液酸酶(Li，Y.-T.etal.Archives of Biochemistry and Biophysics Vol.310，No.1，pp.243-246(1994))。而本发明者曾经发现一种存在于某类组织中如虹鳟鱼卵巢中、同时具有唾液酸酶活性和脱氨基神经氨酸酶活性的酶(Angata，T.et al.，Glycobiology，Vol.4，pp.517-523(1994))。
然而，上述的任何一种酶并非特异地裂解KDN酮苷键。其中一些酶所具有的唾液酸酶活性与裂解KDN酮苷键的活性大小几乎相同(例如前述的来自泥鳅中的酶)，而且其它一些酶具有的唾液酸酶活性强于裂解KDN酮苷键的活性(例如前述的来自虹鳟鱼中的酶)。没有发现特异性作用于KDN的酶已知来自泥鳅酶的最适pH值约为4.5。而本发明者所发现的来自虹鳟鱼酶的最适pH值约为4.4。
已知，在pH6附近，来自泥鳅的酶的脱氨基神经氨酸酶活性值为最适pH时脱氨基神经氨酸酶活性的65％。另外，本发明者发现的来自虹鳟鱼的酶在pH6.5附近无脱氨基神经氨酸酶的活性。因此，在中性pH条件下，很难获得脱氨基神经氨酸酶的反应。另外，上述的任何一种脱氨基神经氨酸酶均来自动物，所有已知的脱氨基神经氨酸酶无一来自微生物。因此，可获得的酶数量是有限的。
本发明说明人们希望有一种脱氨基神经氨酸酶，如果有的话，具有高的活性，并且在中性pH范围内具有活性，这对于分析诸如脱氨基神经氨酸的结构和功能非常有用。如果能得到某种高活性的脱氨基神经氨酸酶，就有希望通过该酶实现催化KDN酮苷键水解作用的逆反应，从而生成诸如新的、含有脱氨基神经氨酸的复合多糖或者糖类。
本发明已将上述的观点考虑在内，即目的是提供一种KDNase，该酶对于KDN的酮苷键具有很强的特异性，并且甚至在中性pH范围内具有高的KDNase活性，对任何一种N-酰基神经氨酸残基均无作用，而非迄今已知的、具有一定KDNase活性的唾液酸酶。
为了实现上述的目的，本发明者努力地筛选出生产KDNase的微生物物种。作为结果，本发明者已发现一种属于Sphingobacterium类(神经鞘菌类)的细菌种属可产生一种KDNase。本发明者进一步发现该KDNase在中性pH范围内具有高的活性，并且不存在唾液酸酶活性。因此实现了本发明的目标。
在此，本发明的脱氨基神经氨酸酶具有以下的酶学特征(1)作用该脱氨基神经氨酸酶作用于含有脱氨基神经氨酸的复合多糖或糖类，它水解由脱氨基神经氨酸形成的酮苷键，以生成游离的脱氨基神经氨酸和完全不含有脱氨基神经氨酸的复合多糖或糖类，以及部分失去脱氨基神经氨酸的复合多糖或糖类。
(2)底物的特异性该脱氨基神经氨酸酶作用于含有脱氨基神经氨酸的复合多糖或糖类，但不作用于含有N-乙酰神经氨酸或N-乙二醇酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid or N-glycolylneuraminic acid)的复合多糖或糖类中的由N-乙酰神经氨酸或N-乙二醇酰神经氨酸形成的酮苷键。
在本发明具体的实施方案中，本发明的脱氨基神经氨酸酶还具有以下的理化性质(I)最适反应pH值该脱氨基神经氨酸酶的最适反应pH值在pH6左右；(II)稳定的pH范围在25℃下，该脱氨基神经氨酸酶pH4至9的范围内稳定；(III)最适反应温度该脱氨基神经氨酸酶的最适反应温度在25℃左右；(IV)热稳定性在25℃下，该脱氨基神经氨酸酶至少在48小时内不会失活；(V)活性抑制和稳定化该酶可被游离的脱氨基神经氨酸抑制，而该酶在存在有小牛血清白蛋白时可被稳定。
在优选的实施方案中，由Sphingobacterium mOL12-4s产生的本发明脱氨基神经氨酸酶具有上述的性质。
另外，本发明提供了一种生产脱氨基神经氨酸酶的方法，包括培养属于Sphingobacterium类的并具有脱氨基神经氨酸酶生产能力的细菌，以及从所获得的培养物中收集具有上述性质脱氨基神经氨酸酶的步骤。还有，本发明提供具有脱氨基神经氨酸酶生产能力的SphingobacteriummOL12-4s菌。
还有，本发明提供了一种方法，用于生产含有脱氨基神经氨酸的糖类和/或复合多糖，包括使得具有上述性质的脱氨基神经氨酸酶与脱氨基神经氨酸、糖和/或复合多糖共存的步骤。
如果需要的话，本发明的KDNase偶尔被称为“本发明的酶”。术语“含有KDN的复合多糖或糖”(“complex carbohydrate orcarbohydrate containing KDN”)指的是KDN经酮苷键与诸如糖蛋白和糖脂的复合多糖，或者与单糖、寡糖或聚糖的糖类连接。术语“含有唾液酸的复合多糖或糖(包括N-乙酰神经氨酸或N-乙二醇酰神经氨酸)”指的是唾液酸通过酮苷键与复合多糖或糖类连接。术语“唾液酸酶的活性”在此所指的是降解含有唾液酸的复合多糖或糖中、由唾液酸形成的酮苷键的活性，而该活性不包括已知的唾液酸酶所具有的KDNase活性。
下面，将对本发明加以详细的说明。<1>本发明的KDNase(1)制备本发明酶的方法本发明的脱氨基神经氨酸酶是一种新的、具有上述性质的酶。本发明的脱氨基神经氨酸酶可通过，例如，培养属于Sphingobactcrium类的细菌而加以制备，并从所获得的细菌培养物中可收集该酶。该细菌属于Sphingobacterium类，例如Sphingobacterium multivorum，其中特别的例子是本发明中分离出的Sphingobacterium mOL12-4s菌。
特别是，可通过下面所述的方法收集所需纯度的酶样品。即，一种生产本发明脱氨基神经氨酸酶的微生物被接种于合适的培养基内，进行培养。经过培养后的微生物细胞(或者是液体培养物的培养液)可通过诸如离心的方法从培养物中加以收集。然后可通过诸如超声处理的方法裂解微生物细胞，以获得细胞溶液。还可以通过诸如渗透休克(osmoticshock)的方法从微生物细胞中获得所需的成份，具有酶活性的成份释放到微生物细胞外。之后，细胞裂解液或是渗透休克处理法所得的成份被当做初料，并以KDNase活性作为指标，用于普通方法分离酶。
将可生产本发明脱氨基神经氨酸酶的微生物，使用有氧培氧的方法，例如振摇培养，通氧和摇动培养，在适合该微生物生长的温度下，培养几个小时或几天，所用的培养基包括，例如，碳源(包括诸如含有KDN的寡糖和葡萄糖)，它们可被微生物吸收，氮源(包括诸如酵母提取物、蛋白胨、肉汁提取物、谷物浸出物、豆粉和酪蛋白水解物(casaminoacids)；以及无机氮源，(如氯化铵、硫酸铵、尿素和硝酸铵)，和无机盐类(例如，包括硫酸盐、磷酸盐和钙、镁、钾和钠的盐酸盐)。
在培养基中加入KDN或含有KDN酮苷键的物质，如含KDN的寡糖醇后(如果需要的话，下文中称为“KDN寡糖醇”)，KDNase被诱导，每个单位数量的微生物细胞内酶的活性得以增加。因此，可以通过能够产生该酶的微生物有效地生产本发明的酶。当培养基中加入的是含KDN酮苷键的物质如寡糖醇时，与加入KDN相比将可获得更明显的酶诱导作用。加入培养基的含KDN酮苷键的物质如寡糖醇没有必要一定是纯品，例如，同样允许使用经初步纯化制得的上述物质。
从培养物中收集的微生物细胞可通过如超声处理的方法加以裂解，或者通过适当的方法如渗透休克的方法制备含有释放酶的组份，从中可通过已知的纯化酶的方法而需得所需纯度酶的样品，其中包括如使用盐析法，如使用硫酸铵((NH4)2SO4)或硫酸钠；透析法；超滤法；吸附色谱法；阴离子交换色谱法；阳离子交换色谱法；疏水色谱法；凝胶过滤法和电泳法；以及使用，如连接有含KDN糖蛋白(KDN-gp)的琼脂糖的亲合层析法。
可通过将本发明的KDNase作用于如含有KDN的复合多糖或糖，通过水解由KDN形成的酮苷键、并定量测定释放的KDN，从而测定该酶的活性。下面的方法是特别的例子，即将本发明的脱氨基神经氨酸酶作用于4-methylumbelliferyl KDN(4-MU-KDN)，以测定经酶催化水解酮苷键所释放的4-甲基馓形酮的荧光。
另外，KDNase的活性也可使用含有KDN糖蛋白的底物加以测定，该糖蛋白来自虹鳟鱼的卵巢液，加入本发明的脱氨基神经氨酸酶进行反应，再加入cetylpyridinium chloride(CPC)以获得反应液，经离心后获得上清，并以硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid)的方法定量测定上清液中KDN的含量(Analytical Biochemistrv，Vol.205，pp.244-250(1992))。在CPC存在下，含有KDN的糖蛋白形成复合物，可被沉淀，而经酶作用释放的KDN不会被沉淀。因此，未反应的含KDN的糖蛋白可通过离心的方法从反应体系中除去。上述的方法将在后面的实施例中加以专门的说明。(2)本发明脱氨基神经氨酸酶的理化性质用KDNase代表的本发明脱氨基神经氨酸酶由SphingobacteriummOLl2-4s菌产生，并具有以下的理化性质。1)作用本发明的脱氨基神经氨酸酶作用于含有KDN的复合多糖或糖，水解连接KDN与复合多糖或糖之间的酮苷键，生成游离的KDN和无KDN的复合多糖或糖，或者部分失去KDN的复合多糖或糖。已证明，本发明的脱氨基神经氨酸酶亦作用于KDN与其它非复合多糖或糖的化合物间的酮苷键，例如4-methylumbelliferyl KDN的酮苷键。
做为本发明脱氨基神经氨酸酶作用于KDN和乳糖混合液的结果之一，发现反应液中存在有含KDN的寡糖链。因此，这表明本发明的脱氨基神经氨酸酶同样催化上述水解反应的逆反应。使用这一逆反应，可通过将本发明的脱氨基神经氨酸酶、KDN和糖和/或多糖及其类似物的共同混合而有可能生成含有KDN的糖和/或多糖及其类似物。2)底物特异性本发明的脱氨基神经氨酸酶作用于和裂解由脱氨基神经氨酸(KDN)形成的酮苷键，但对N-乙酰神经氨酸或N-乙二醇酰神经氨酸形成的酮苷键无作用。
本发明的脱氨基神经氨酸酶裂解存在于下列含有KDN的复合多糖或糖及其类似物中的所有KDN残基。该酶作用于自然界中已知的任何一种含KDN的残基，即α2→3，α2→6和α2→8酮苷键(a)含KDN的糖蛋白与大量糖链连接的粘蛋白(mucin)样糖蛋白，糖链上含有3种类型的KDN键(KDNα2→3Gal，KDNα2→8KDN和KDNα2→6Gal NAc)；(b)通过将含KDN的糖蛋白与alkaliborohydride处理后获得的KDN寡糖醇通式为(→8KDNα2→)n→8KDNα2→6[KDNα2→3Galβ1→3GalNAcα1→3]GalNAc-01，其中n为2至9，平均数为5；(c)KDN二聚体，KDNα2→8KDN；(d)通过α2→3Gal连接的具有两个KDN残基的N-类型糖链KDNα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→2Manα1→6[KDNα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→2Manα1→3]Manβ1→4GlcNAcβ1→4GlcNAc；(e)含有KDN的神经鞘糖脂(sphingoglycolipid)，含有KDN的神经节苷脂(ganglioside)GM3KDNα2→3Galβ1→4Glcβ1→Cer；以及(f)4-methylumbelliferyl KDN。
另一方面，本发明的脱氨基神经氨酸酶不催化水解在已知的含唾液酸(N-乙酰神经氨酸和N-乙二醇酰神经氨酸)的复合多糖或糖中由唾液酸形成的酮苷键(见后面的实施例2)。因此，本发明的脱氨基神经氨酸酶对脱氨基神经氨酸形成的酮苷键具有极高的特异性。3)最适反应pH值在pH6附近，本发明的脱氨基神经氨酸酶具有最高的反应活性。
如后面的实施例2所述，将sphingobacteriummOL2-4s菌的细胞裂解液上清通过50-70％硫酸铵的沉淀作用所得到的初始组份，通过使用Sepharcyls-200(Pharmacia产品)色谱柱纯化两次，再经过接有含KDN糖蛋白(KDN-gp)的琼脂糖凝胶色谱柱(Affi-gel 15，Bio Rad产品)可获得本发明脱氨基神经氨酸酶经亲合纯化的酶组份。图8显示了亲合纯化所得酶组份的酶活性与pH值之间的关系。如后面实施例2所述，经纯化所得酶样品在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈现出单一的条带(如果需要的话，在后面称该酶为“单一纯化的酶”)，而该酶是将Sphingobacterium mOL2-4s菌的细胞裂解液上清经过90％硫酸铵沉淀作用所得到的初始组份，通过连续使用CM-Toyopearl 650M(Toyo Soda产品)、DEAE-Toyopearl 650M(Toyo Soda产品)和CM-Toyopearl650M(Toyo Soda产品)色谱柱而纯化所得。图9显示了使用单一纯化酶的酶活性与pH值之间的关系。4)最适反应温度对于本发明的脱氨基神经氨酸酶，在25℃至30℃之间可获得高的酶反应活性。5)稳定性在25℃、pH4至9下放置数小时后，本发明的脱氨基神经氨酸酶具有相当的稳定性。在25℃下，本发明的酶至少保持48小时不失活。然而，无论pH或离子强度如何，本发明的酶在数十个μg/ml或稍低的浓度下是不稳的，但是，在存在其它蛋白如牛血清白蛋白时，可使本发明的脱氨基神经氨酸酶稳定。6)酶活性的抑制和活化本发明的脱氨基神经氨酸酶的活性不受1mM钙离子(Ca2+)、镁离子(Mg2+)、锰离子(Mn2+)和EDTA(乙二胺四乙酸钠，Sodiumethylenediaminetetraacetic acid)的影响。
当离子强度增加时，本发明的脱氨基神经氨酸酶的活性迅速增加。例如存在300mM NaCl时，酶的活性具有最高值，而在低离子强度50mM或更低时NaCl时，酶的活性极低。
本发明的脱氨基神经氨酸酶的活性可被游离的KDN抑制(在3mMKDN浓度下)。与此相反，本发明的KDNase酶活性不被游离的唾液酸抑制，而唾液酸是脱氨基神经氨酸(KDN)的结构类似物，亦不被含有N-乙酰神经氨酸或N-乙二醇酰神经氨酸的复合多糖或糖抑制，它们不能成为该脱氨基神经氨酸酶的底物。本发明的脱氨基神经氨酸酶不被2，3-二羟基-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸所抑制，而该化合物是已知的、裂解N-酰基神经氨酸所形成酮苷键的唾液酸酶的特异性抑制剂。
表面活性剂Triton X-100不抑制本发明脱氨基神经氨酸酶的活性。该酶在0.5％胆酸钠(Sodiumcholate)时活性完全消失，而在0.1％胆酸钠时，90％的酶活性得以保持。因此，当使用该酶作用于含KDN的糖脂如含KDN的ganglioside时，可以加入Triton X-100。7)分子量如后面的实施例2所述，对于亲合纯化所得的酶组份，本发明脱氨基神经氨酸酶经凝胶过滤法测定的分子量约为50,000(Sephacryl S-200柱，1.8cm×135cm；用20mM Tris-Hcl缓冲液(pH8.0)/0.5M NaCl洗脱)，或者经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定约为57,000；而该亲合纯化的酶组份是将Sphingobacterium mOL2-4s菌的细胞裂解液上清通过50-70％硫酸铵的沉淀作用所得到的初始组份，通过使用Sephacryl S-200(Pharmacia产品)色谱柱纯化两次，再经过接有含KDN糖蛋白(KDN-gp)的琼脂糖凝胶色谱柱(Affi-gel15，Bio Rad产品)而获得的。
如后面的实施例2所述，对于单一纯化的酶，本发明脱氨基神经氨酸酶经凝胶过滤法测得的分子量约为40,000(Sephacryl S-200柱，1.8cm×135cm；使用20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)/0.2M NaCl)，或经SDS聚丙烯酰胺法测得的分子量约为42,000；而该单一纯化的酶是按照Nossal和Heppel的渗透休克法(J.Biol.Chem.，Vol.241，pp.3055至3062(1966)，而且把原方法的经过1mM Mg(CH3COO)2处理10分钟后通过离心获得上清的操作作了修改，改成经过1mM Mg(CH3COO)2处理10分钟后，加入2倍体积的1M NaCl-1M Tris-HCl(pH7.1)，再离心以获得上清)，将Sphingobacterium mOLl2-4s菌的微生物细胞渗出外周质(periplasm，peripheral cytoplasm)制备液经过90％硫酸铵沉淀作用所得到初始组份，通过连续使用CM-Toyopearl 650M(ToyoSoda产品)、DEAE-Toyopearl 650M(Toyo Soda产品)和CM-Toyopearl 650M(Toyo Soda产品)色谱柱而纯化所得。8)(酶反应动力学的)Michaelis常数以4-methylumbelliferyl KDN(4-MU-KDN)做为底物，本发明脱氨基神经氨酸酶的Michaelis常数(Km)和最大酶反应速度(Vm)如下。
Km19μMVmax0.19μM/min或7.4mM/min/mg蛋白9)氨基酸组成本发明的脱氨基神经氨酸酶具有以下的氨基酸组成。数字以摩尔百分率(％)表示。
天门冬酰胺和天门冬氨酸 5.3谷氨酰胺和谷氨酸 5.5丝氨酸 13.6甘氨酸 19.8组氨酸 2.0精氨酸 2.0苏氨酸 6.7丙氨酸 9.0脯氨酸 3.5酪氨酸 5.6缬氨酸 5.9甲硫氨酸 7.6异亮氨酸 3.5亮氨酸 4.9苯丙氨酸 3.2赖氨酸 2.0<2>本发明的Sphingobacterium mOL12-4s菌本发明的微生物，即Sphingobacterium mOL12-4s菌，最初取自鱼塘的淤泥，经过包括含脱氨基神经氨酸(KDN)的寡糖醇做为唯一碳源的丰富培养基的培养而获得，并经过筛选，该细菌的细胞裂解液具有水解4-MU-KDN的活性。本发明微生物的特征在于能够产生上述的、无唾液酸酶活性的KDNase。
使用与上述内容相似的方法，将最初取自鱼塘或类似地点的土壤或淤泥，经过包括含KDN复合多糖或糖及其类似物做为唯一碳源的浓缩培养基的培养，亦可获得本发明的微生物，并经过是否具有KDNase活性作为指标筛选。值得注意的是，按本发明所分离到的SphingobacteriummOL12-4s菌已于1994年5月24存入国际贸易和工业部(Ministryof International Trade and Industry)中工业科学和技术机构(Agency ofIndustrial Science and Technology)的生命科学和人类技术国立研究所(National Institute of Bioscience and Human Technology)，贮藏编号为FERMP-14325，并于1995年5月26日依照布达佩斯条约(BudapestTreaty)转入国际贮存库，其贮存编号为FERM BP-5116。
在下面的实施例1中，将对本发明微生物所具有的微生物学性质加以说明。按照该菌的性质，经过鉴定，本发明的微生物可能是属于Sphingobacterium种属细菌的一种，并且极可能是Sphingobacteriummultivorum菌。
附图简述
图1显示不同培养时间下对一定数量微生物细胞(1010个)中KDNase活性的测定结果，该数据来自对Sphingobacterium mOL12-4s菌在加有0.1％粗提的KDN-OS(虹鳟鱼的制备组份，富含KDN寡糖醇(KDNα2→3Galβ1→3GalNAcα1→3[KDNα2→(8KDNα2→)n→6]Ga1Nacol；其中n＝5))培养基中的培养物。
图2显示本发明酶纯化过程中使用第一级Sephacryl S-200凝胶过滤色谱的洗脱图。实线代表酶的活性，虚线为表示蛋白含量的紫外吸收(A280)。
图3显示本发明酶纯化过程中使用第二级Sephacryl S-200凝胶过滤色谱的洗脱图。实线代表酶的活性，虚线为表示蛋白含量的紫外吸收(A280)。
图4显示本发明酶纯化过程中使用第一级KDN-gp连接琼脂糖的亲合色谱的洗脱图。实线代表酶的活性，虚线为表示蛋白含量的紫外吸收(A230)。
图5显示本发明酶纯化过程中使用第二级KDN-gp连接琼脂糖的亲合色谱的洗脱图。实线代表酶的活性，虚线为表示蛋白含量的紫外吸收(A220)。
图6显示本发明酶纯化过程中使用第二级CM-Toyoperal 650M柱色谱的洗脱图(单一纯化的酶组份)。实线代表酶的活性，虚线代表洗脱时NaCl的浓度。
图7显示亲合纯化酶组份的10％丙烯酰胺电泳的结果。经银染后，使用光密度仪分析每个条带的位置和染色强度(测定600nm的吸收)。
图8显示了pH-酶活性曲线，提示本发明酶经亲合纯化酶组份的最适pH值。
图9显示了pH-酶活性曲线，提示本发明酶的单一纯化酶样品的最适pH值。
图10显示了离子强度-酶活性曲线，提示本发明酶的最适离子强度。离子强度用加入的NaCl浓度表示。
实施本发明的最佳方案在下面做为参照的实施方案中，将对本发明做更明确的解释。然而，实施方案只是对本发明的说明，并非对本发明的限制。在实施方案中，可按照下列的方法测定KDNase的活性。<测定酶活性的方法>(1)基于使用4-methylumbelliferyl KDN(4-MU-KDN法)的方法当按照下列反应式对4-methylumbelliferyl KDN(4-MU-KDN)的酮苷键进行酶催化水解时，具有荧光的4-methylumbelliferone被释放出来，因此可以测到荧光。
4-methylumbelliferyl KDN→KDN-4-甲基繖形酮特别是，将该酶溶解在20μl的0.1M Tris-乙酸缓冲液(pH6.0)/0.1M NaCl，并把1.4nmol的4-MU-KDN加入该酶溶液中，并在25℃下进行反应30分钟。反应后，将1份体积的反应液(20μl)与2.5ml的85mM甘氨酸-碳酸盐缓冲液(pH9.3)混合，以测定荧光强度(激发波长365nm，测定波长450nm)。为测定荧光强度，请参照Biochemistry，Vol.18，No.13，pp.2783-2787。将按照上述方法、但不加酶进行反应后所测得的荧光强度作为对照。将25℃下，每分钟水解1nmol4-MU-KDN的酶量定义为1个单位。
按照下述的Dr.Thomas G.Wamer建立的方法，制备本方法中所使用的4-MU-KDN。本法所用的4-MU-KDN由Dr.Thomas G.Warner惠赠。
KDN是按照已知的方法[Auge，C.etal.，Tetrahedron，46，201-214(1990)]，使用Neu 5Ac醛缩酶(aldolase)将D-甘露糖和丙酮酸催化合成而来。将KDN干燥，然后混悬于10ml的乙酸酐和10ml的吡啶中，并继续在室温下反应过夜。反应液用冰冷却。加入甲醇终止反应，并去除溶剂。残余物溶于甲醇，上Dowex 50(H+)柱(4×5cm)，用甲醇洗脱。除去溶剂后，往洗脱物中加入过量的溶于乙醚的重氮甲烷(diazomethane)以生成甲酯。完全乙酰化的甲酯，上硅酸柱(2.5×17cm)，并用溶于己烷的乙酸乙酯梯度洗脱，并获得甲基-2，4，5，7，8，9-六-O-乙酰基KDN(甲基-2，4，5，7，8，9-六-O-乙酰基KDN，K1)。然后，将K1转入glycosyl Chloride，按照已知的方法[Wamer etal.，Biochemistry，18，2783-2787(1979)]，与4-methylumbelliferone钠盐(4MU)反应，这样K1和4-MU聚合形成4-甲基-2-氧代-2H-1-苯并吡喃-7-基4，5，7，8，9-五-O-乙酰KDN(K2)。
将K2(0.5g)加入4ml的甲醇，然后是4ml的0.5N NaOH，K2在其中混悬，并在37℃下维持1小时。再加入4ml的NaOH，并继续在37℃维持90分钟。然后，加入Dowex 50(H+)树脂将pH值中和至pH6.0。将树脂通过过滤而去除，并去除溶剂。往残余物中加入少量的氨水(10mM)使pH到9，接着用Sephadex G-25凝胶滤过法，将4-MU-KDN纯化至很高纯度。
另外，4-MU-KDN也可按照Schreiner，E.和Zbiral，E.(1990)Liebigs Ann.chem.，581-586.所述的方法获得。(2)氯化十六烷基吡啶鎓，CPC法将虹鳟鱼卵巢液中取得的含KDN糖蛋白作为底物。按照与上述方法(1)相同的条件，进行酶的反应。然后，往反应液中加入2ml的0.1％cetylpyridinium chlorde(CPC)。在CPC存在条件下，含KDN的糖蛋白会形成复合物进而沉淀。然而，经酶反应所释放的KDN不会沉淀。该反应液放置30分钟，然后离心(3,000rpm，10分钟)以获得上清。按照硫代巴比妥酸的方法，通过定量测定所得上清中KDN的含量而确定脱氨基神经氨酸酶的活性(Analytical Biochemistry，Vol。205，pp.244-250(1992))。将25℃下，每分钟水解1nmol的含KDN糖蛋白的酶量定义为1个单位。
实施例一Sphingobacterium mOL12-4s的获取将从鱼塘中获得的淤泥接种于M9液体培养基中(在1升体积中含有6.0克的Na2HPO4，3.0克KH2PO4，1.0克的NH4Cl，0.5克的NaCl，1mM MgSO4和0.1mM CaCl2)，加入0.05％KDN寡糖醇(按照J.Biol.Chem.，265，21811-21819(1990)所述的方法制备)，在25℃下培养48小时，将所获得的培养液划线接种于含KDN寡糖醇的Mg琼脂培养平皿上，并于25℃下培养48小时。由此获得了可在KDN寡糖醇作为唯一碳源的培养条件下生长的66个微生物克隆。
将所形成克隆中相应的微生物分别接种于含有0.05％KDN寡糖醇的M9液体培养基中进行培养，并通过离心的方法收集微生物细胞。通过超声处理的方法裂解收获的微生物细胞。按照4-MU-KDN的方法测定KDNase的活性和唾液酸酶的活性。其中，对于那些具有KDNase活性而无唾液酸酶活性的细胞裂解液，其来源的微生物克隆被称为mOL12菌株，并用于下面的筛选。
将mOL 12菌株的克隆划线接种于含0.05％KDN寡糖醇的M9琼脂培养基中，从中分离出4个菌株的克隆，并将它们分别命名为mOL12-1、mOL12-2、mOL12-3和mOL12-4。将克隆分别划线接种于LB平皿培养基中以获得单一的克隆，并将单个克隆接种于含0.05％KDN的寡糖醇液体培养基中进行培养。从中制备细胞裂解液，并按照4-MU-KDN法和氯化十六烷基吡啶鎓法分别测定KDNase的活性和唾液酸酶的活性。划线接种在LB平皿培养基上而形成的mOL12-4菌株克隆按其大小可分为三种类型，即“大型的”、“中型的”和“小型的”。其中，在所形成的“大型的”克隆和“中型的”克隆菌株中未发现KDNase的活性。然而，在“小型的”克隆菌株中存在有KDNase活性而且无唾液酸酶活性。从只存在KDNase活性菌株挑选出一种菌株，并将其命名为mOL12-4s。
使用商购的试剂盒(Biomeleu生产，API 20NE)对上述分离的mOL12-4s菌株进行鉴定，该试剂盒用于确定肠道杆菌之外的革兰氏阴性杆状菌。测定所得的主要微生物特性如下形状 杆状革兰氏染色 阴性芽胞形成 -活动性 -对氧气喜好 需氧菌吲哚产生 -葡萄糖发酵 -尿素降解 +七叶苷降解(esculin degradation)+同化作用葡萄糖 +L-阿拉伯糖 +D-甘露糖+D-甘露糖-麦芽糖 +过氧化氢酶 +过氧化物酶 +β-半乳糖苷酶 +按照上述的结果，mOL12-4s菌株被鉴定为属于Sphingobacterium菌属的一种细菌，并称其为Sphingobacterium mOL12-4s菌株。这一菌株已于1994年5月24日存入国际贸易和工业部中工业科学和技术机构的生命科学和人类技术国立研究所，储存号为FERMP-14325，并于1995年5月26日依照布达佩斯条约(Budapest Treaty)转入国际储存库，编号为FERMBP-5116。根据其微生物性质，该菌株极可能是Sphingobacterium multivorum。
实施例2KDNase的制备配制800ml含有Miller′s Luria肉汁(LB，Bibco BRL生产)的液体培养基，倒入2升的Erlenmeyer瓶，并高压灭菌。将SphingobacteriummOL12-4s菌株接种于该培养基中，并在25℃下振摇培养48小时。<1>KDNase的提取和硫酸铵分离(1)通过对微生物细胞裂解而提取KDNase和硫酸铵的分离培养结束后，通过离心法(15,000xg，40分钟)，从培养液中收集细胞细胞，收获的细胞悬浮于冰冷的、含0.1M NaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，并再次通过离心清洗细胞。这一清洗操作重复三次。之后，将细胞细胞悬浮于1/2细胞体积的、0.1M NaCl-20mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)中。通过超声处理(50瓦，5分钟)的方法裂解细菌细胞。
冷却条件下，将细胞裂解液离心(17,000xg，40分钟)以获取上清。上清中加入硫酸铵至50％饱和度，然后于4℃放置1小时。将溶液于150,000xg离心1小时以去除沉淀。获得的上清中加入硫酸铵至70％的饱和度，然后于4℃放置过夜。溶液再次于150,000xg离心1小时以获得沉淀，将沉淀溶于10ml的0.5M NaCl-20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，往溶液中加入硫酸铵的饱和水溶液至43％的饱和度，然后于4℃放置1小时。将溶液于150,000xg离心1小时经获得上清，并在上清液中加入硫酸铵至85％饱和度，然后于4℃放置过夜。通过150,000xg离心1小时的方法将生成的沉淀回收，并将收得的沉淀溶于10.9ml的0.5M NaCl-20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中。所收获的这一组份称为50-70％硫酸铵的沉淀组份。(2)渗透休克法提取KDNase的硫酸盐析分离从细菌细胞中提取KDNase的另外一种方法是，通过对细菌细胞应用渗透休克，使酶释放至细胞外。所获得的细胞外溶液被用于硫酸铵盐析分离，经纯化KDNase。
按照上述相同方法培养的Sphingobacterium mOL12-4s菌株，通过离心(15,000xg，40分钟)的方法收集和清洗细菌细胞。按照已知的方法[Nossal，N.G.and Heppel，L.A.(1996)J.Biol.Chem.241，3055-3062]对细菌细胞进行渗透休克处理，使酶释放至细胞外。即，以1克细菌细胞加至40ml体积的方法，将细菌细胞悬浮于含有20％蔗糖的20mMTris-HCl缓冲液(pH7.1)中，然后放置10分钟。之后，通过离心(13,000xg，30分钟)的方法将细胞沉淀。通过将细胞悬浮含有1mM氯化镁的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.1)中，对细菌细胞进行渗透休克，并放置10分钟。
将细菌细胞的悬浮液重新离心(13,000xg，30分钟)以去除细胞。获得的上清液迅速加入硫酸铵至90％的饱和度，然后于4℃放置过夜。经离心(15,000xg，30分钟)收集生成的沉淀，将沉淀溶于50％饱和度的硫酸铵溶液，并用离心(15,000xg，30分钟)的方法将不溶的悬浮物质去除。所获的上清液中加入硫酸铵至70％饱和度，然后于4℃放置过夜。通过对溶液再次离心(15,000xg，30分钟)以获得沉淀组份，并以50-70％的硫酸铵沉淀组份加以收集。(3)Sphingobacterium mOL12-4s菌株中KDNase的诱导(3-1)诱导剂的制备按照已知的方法(Kitajima，K.et al.，J.Biol.Chem.，269，21415-21419(1994))制备KDN和KDN寡糖醇(用KDN α 2→3Gal β1→3GalNAc α 1→3[KDN α 2→(8KDN α 2→)n→6]GalNacol，其中n＝5，如果需要后面将其称作“KDN-OS”)。可如下制备富含KDN-OS的组份(如果需要后面将其称作“粗制KDN-OS”)。将虹鳟鱼卵巢液(12.3升)浓缩和冻干，获得110克的干粉。取冻干粉(50克)，用1.0升的氯仿/甲醇(2∶1，v/v)在室温下萃取2小时(见Yu，s.etal.，Biochemistry，32，9221-9229(1993))。将去除脂肪后的残余物空气中晾，称重量为39克。将去脂的卵巢液粉末(10克)悬浮于100ml的1M NaBH4/0.1M NaOH中，并在37℃下搅拌温育。温育24小时后，加入50ml的同样溶液(1M NaOH4/0.1M NaOH)，然后再温育24小时。反应地9,000xg下离心20分钟，然后加入冰醋酸中和pH至6.0左右。之后，使用Sephadex G-25(Pharmacia生产)色谱(2.0×150cm，用水洗脱)将上清液脱盐。脱盐后的组份富含KDN-OS，并称为粗制KDN-OS。按照TBA法(Kitajima，K.et al.，Anal.Biochem，205，244-250)定量测定KDN。(3-2)诱导酶的实验将Sphingobacterium mOL 12-4s菌细胞(1×108个)接种于40ml含有1％(w/v)酪蛋白水解物(Casamino acid，Gibco生产)和1％(w/v)葡萄糖(Glc)的M9液体培养物基中，并于25℃下44培养物小时。收集处于生长期的微生物细胞(细菌细胞)，并用M9液体液体培养物基洗涤两次。将细菌细胞(6.1×1010个细胞)接种于2.0ml含有0.1％(w/v)粗制KDN-OS，KDN-OS，KDN，Neu5Ac，多聚乙酰神经氨酸的酸性水解物(oligo-Neu5Ac；Kitazume，S.etal.，Anal.Biochem.，202，25-34(1992))，或者Glc的M9液体培养物基，并且于25℃温育24小时，以测定可生长的细胞个数和KDNase活性。通过稀释每个温育后细胞培养物液，并将所得的每个稀释好的溶液接种于LB琼脂培养物平皿，并计数生长的克隆数从而确定原培养物液中的细胞个数(Kitajima，Ket al.，j.Biol.Chem.，269，21415-21419)。为测定细胞中KNDase的活性，通过5,000rpm或1,500xg下离心10分钟收集细胞。将收集到的细胞悬浮于0.5ml含有100mM Tris-乙酸缓冲液(pH6.0)中，并用超声的方法裂解细胞(50瓦，1分钟)。将裂解制备物于10,000rpm或6,000xg下离心10分钟，进而获得可用于测定KDN活性的上清液。结果见表1。表1[]中的数值表示酶活性的比值，并将未加入(诱导剂)前的活性值作为1。
表1加入的物质细胞数KDNase 一定细胞中KDNase活性活性 (百万单位/每1010个细胞)(百万单位)加入前 6.1×1010[1] 20[1]3.3[1]Glc 1.7×1012[1] 80[4]0.47
KDN-OS 1.5×1012[25] 7500[380]50[15]粗制KDN-OOS 5.7×1012[93] 2300040[12]KDN 3.6×1010
38[1.9] 11[3.3]Neu5Ac 2.5×1010
15
6.0[1.8]Oligo-Neu5Ac3.0×1010
12
4.0[1.2]在加入0.1％粗制KDN-OS后，测定了随着培养的变化、一定数量(1010个)细胞中KDNase的活性。结果见图1。
作为结果，KDN，KDN-OS和粗制KDN-OS诱导了KDNase，然而，其它的单糖和寡糖对酶的诱导没有作用。游离的KDN同样可诱导KDNase，但是未见与KDN-OS和粗制KDN-OD等强的诱导作用。据此，我们建议优选含有KDN形成酮苷键的物质作为诱导剂。
图1表明，当把增殖的细菌细胞(6.0×1010个)接种于含有0.1％KDN-OS的M9培养基中，在温育24小时至43小时后，每个细胞中的KDNase活性与培养开始时的活性相比增加到一个非常高的水平。<2>KDNase的纯化将全部的、按照前文(1)中所得到的5-70％硫酸铵沉淀组份用于Sephacryl S-200(Phamacia生产)柱(1.8×135cm)，并用含0.5M NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)洗脱。因此通过凝胶过滤进行了组份分离(图2)。按照4-MU-KDN法测定了每个洗脱组份的KDNase活性。收集有活性的组份，并加入硫酸铵至90％饱和度，然后放置物过夜。将该溶液于150,000xg离心1小时，得到的沉淀溶于4.7ml的20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)/0.5M NaCl并按照上述使用Sephacryl S-200柱相同的方法再次进行凝胶过滤，以收集KDNase的活性组合物(图3)。
将收集到的KDNase活性组份中加入硫酸铵至90％饱和度，然后放置过夜。将该溶液于150,000xg离心1小时，得到的沉淀溶于4.8ml的20mM Tris-乙酸缓冲液(pH6.0)/0.05M NaCl。该溶液用于填充了连接有含KDN糖蛋白(KDN-gp)的琼脂糖凝胶(Affe-gel 15，Bio Rad生产)柱(2.0×15cm)，并连续使用90ml 20mM Tris-乙酸缓冲液(pH6.0)/0.05M NaCl和135ml 20mM Tris-乙酸缓冲液(pH6.0)/0.5MNaCl洗脱(图4)。有一部分的活性组份未被吸附，是由于样品负载超过了柱子的吸附能力。在前面所得到的凝胶柱上，将活性组份中未被洗脱的部分再次上柱和吸附，然后用20mM Tris-乙酸缓冲液(pH6.0)/0.5M NaCl洗脱(图5)。因此收集到了所有吸附于连接有KDN-gp琼脂糖凝胶的、可被高离子强度洗脱的酶组份(15ml)。使用超滤(Centriflow CF25，Amicon生产)的方法将所收集到的酶组份浓缩至最多为2ml，并称为亲合纯化的酶组份。
测定了每一纯化步骤中所获酶组份的酶活性、蛋白含量、产率和纯度。按照4-MU-KDN法测定了KDNase的活性，其中25℃下、每分钟每产生1nmol 4MU的酶量被定义为1个单位，按照修改了的Lowry法定量测定蛋白的的含量(BCA试剂，Pierce，U.S.A)，其中使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准，测定230nm的吸收，结果见表2。
表2组份 活性 蛋白 比活 产率纯化度(单位) (mg) (单位/mg)(％)(倍数)细胞裂解液 153 2070.737 100 1.050-70％ 113 1031.11 74.2 1.5(NH4)2SO4组份第一级 76.1 57.3 1.33 49.8 1.8SephacrylS-200第二级 57.4 26.6 2.16 37.6 2.9SephacrylS-200KDN-gp 52.2 0.410 12734.2 173琼脂糖吸附组份将亲合纯化的酶组份进行10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后使用银染试剂盒(Wako Pure Chemical生产)对凝胶进行染色，使用光密度扫描仪(测定600nm的吸收)对所染的5或6个条带的位置和光密度进行了测定，结果见图7。
使用Sephacryl S-200凝胶过滤柱对上述酶组份作进一步的分离，并在Kav 0.3-0.4时洗脱获得7个具有KDNase活性的组份，并且对于这7个组份的KDNase活性与其在SDS聚丙烯凝胶电泳上所测得的带行为间的关系作了细致的研究。作为结果，发现了对应单-组份的一个条带，该条带所显示的类型与其活性值相符，因此判断它是KDNase的条带。与分子量标记物(Seikagaku公司产品)比较，该条带的表观分子量计算为57,000。另外，通过凝胶滤过色谱法所得到的活性组分，经过与分子量标记物(Seikagaku公司产品)比较，算出的分子量为50,000，这与SDS-PAGE所得的结果基本一致。图7显示了亲合纯化酶组份SDS-PAGE的类型，其中所示的条带位置被认为是KDNase。
通过上述的纯化步骤无法将KDNase完全纯化。然而，粗制的酶溶液，如细胞裂解液，以及亲合纯化的酶组份都可以用作具有无唾液酸酶活性的KDNase。如果需要的话，可按照普通酶纯化的方法对该酶作进一步的纯化。在那些纯化过程中，KDNase的活性和估计出的分子量可作为指标。
本发明者使用下列的方法将KDNase成功地纯化至SDS-PAGE上的均一水平，在适度搅拌的同时，向渗透休克法获得的细胞裂解液上清中一点点地加入硫酸铵至90％的饱和度，然后于4℃放置过夜。通过在17,000xg下离心30分钟的方法回收沉淀。将回收的沉淀溶于10ml的0.1MNaCl-100mM Tris-乙酸缓冲液(pH6.0)中，并用0.1M NaCl-0.25M蔗糖-20mM Tris-乙酸缓冲液(pH6.0)进行透析。透析后，溶液上CM-Toyopearl 650M柱(2.2×11cm，42ml；Toyo Soda生产)，该柱已用相同透析缓冲液(0.1M NaCl-0.25M蔗糖-20mM Tris-乙酸缓冲液(pH6.0))平衡，柱子先用60ml相同的缓冲液(0.1M NaCl-0.25M蔗糖-20mM Tris-乙酸缓冲液(pH6.0))洗脱，然后用400ml含线性浓度梯度NaCl(0.1M至0.6M)的0.25M蔗糖-20mM Tris-乙酸缓冲液(pH6.0)洗脱。将通过的组份(pass-through fractions)合并成一个溶液，用超滤(YM10，Amicon生产)的方法浓缩至15ml。浓缩的溶液用于DEAE-Toyopearl 650M柱(2.2×11cm，42ml；ToyoSoda生产)，柱子用0.1M NaCl-0.25M蔗糖-20mM Tris-缓冲液(pH8.0)平衡，然后先用相同的平衡缓冲液(0.1M NaCl-0.25M蔗糖-20mM Tris-缓冲液(pH8.0))60ml洗脱，再用60ml的0.5M NaCl-0.25M蔗糖-20mM Tris-缓冲液(pH8.0)洗脱。未被柱子吸附的组份汇集得到汇集溶液，并用超滤的方法浓缩至13ml。浓缩液上CM-Toyopearl 650M柱，柱子用0.1M NaCl-0.25M蔗糖-20mM Tris-缓冲液(pH8.0)平衡，柱子先用0.1M NaCl-0.25M蔗糖-20mM Tris-缓冲液(pH8.0)洗脱。然后用含线性浓度梯度NaCl(0.1M至0.6M)的0.25M蔗糖-20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)洗脱，以收集具有KDNase活性的组份(0.17至0.2M NaCl附近)。将收集到的组份合并后上SDS-PAGE电泳，作为结果，可确定有单一的条带。
按照上述方法获得的单一纯化的酶，在SDS-PAGE电泳上与分子标志比较，其表观分子量计算约为42,000。通过凝胶滤过色谱法(Sephacryl S-200柱，1.8cm×135cm；用20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)/0.2M NaCl洗脱)评估分子量，与分子量标志比较，计算值约为40,000左右<3>本发明脱氨基神经氨酸酶的性质使用前述方法所获得的亲合纯化酶组份，研究了本发明脱氨基神经氨酸的性质。(1)底物特异性研究了本发明脱氨基神经氨酸酶对于不同的含KDN复合多糖和糖类，以及含唾液酸复合多糖和糖类的反应活性。
其中所使用的含KDN复合多糖和糖类，以及含唾液复合多糖和糖类的获取方法和来源如下KDN二聚体，N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)二聚体，N-乙二醇酰神经氨酸(Neu5Gc)二聚体Anal.Biochem.，202，25-34(1992)。
含KDN的双链N-型糖链Biochemistry，33，6495-6502(1994)。
KDN寡糖醇含KDN糖蛋白J.Biol.Chem.，265，21811-21819(1990)。
含KDN神经节苷脂(ganglioside)GM3J.Biol.Chem.，266，21929-21935(1991)。
4-Methylumbelliferyl Neu5Ac，多聚乙酰神经氨酸购自NakaraiChemical。
N-乙酰神经氨酸乳糖，人转铁蛋白(Huamn transferrin)，胎牛血清胎球蛋白购自Sigma。
含Neu5Ac的双链N-型糖链J.Biol.Chem.，264，18520-18526(1989)。
猪颌下腺粘蛋白Arch.Biochem.Biophys.，129，49-56(1969)。
湖鳟鱼多糖蛋白，虹鳟鱼多糖蛋白，arctic char多糖蛋白J.Biol.Chem.，268，23675-23684(1993)。
含Neu5Ac神经节苷脂GM3、Neu5Ac神经节苷脂GM1Biochem.J.，441，488-497(1976)。
Neu5Ac α 2→6(Gal β 1→3)GalNAcol，蟾蜍卵巢状糖蛋白Enr.J.Biochem.，223，223-231(1994)。
在10μl含0.1N NaCl的0.1M Tris-乙酸缓冲液(pH6.0)中，将相当于5μg KDN或N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)或N-乙二醇酰神经氨酸(Neu5Gc)的、每个上述含KDN唾液酸的复合多糖或糖类，与本发明的脱氨酸神经氨酸酶(80个百万单位)在25℃下共存20小时。
将反应液点样于硅胶薄层板上(Merck生产)，用1-丙醇∶25％氨水∶水＝6∶1∶2.5(体积比)展开7个小时。展开后，将平板干燥，喷10％硫酸乙醇溶液。平板在120℃加热，使展开的复合多糖或糖类、以及释放的KDN、Neu5Ac或Neu5Gc变色。作为对照，进行反应时不加入酶。结果见表3。其中有KDN、Neu5Ac或Neu5Gcc释放的表为“+”，而无KDN、Neu5Ac或Neu5Gcc释放的表为“-”。
根据这一结果，表明本发明的脱氨基神经氨酸酶不仅把4-MU-KDN作为合成的底物，而且作用于任何一种、自然存在并已知的、由KDN残基形成的α2→3、α2→6、α2→8键形式的酮苷键。
对于表3所示的含有N-乙酰神经氨酸或N-乙二醇酰神经氨酸的各种复合多糖和糖类，本发明的脱氨基神经氨酸酶不能水解由N-乙酰神经氨酸或N-乙醇酰神经氨酸形成的酮苷键、因此，本发明的脱氨基神经氨酸酶对于脱氨基神经氨酸具有高度的特异性。
表3复合 键 存在或无裂解4-MU-KDN+KDN二聚体 KDNα2→8KD +含KDN的双链N-型糖链 KDNα2→3Gal+KDN寡糖醇 KDNα2→8KDN，KDNα2→3Gal +KDNα2→6GalNAcol含KDN糖蛋白 KDNα2→8KDN，KDNα2→3Gal +KDNα2→6GalNA含KDN的神经节苷脂GM3KDNα2→3Gal+4MU-Neu5AcNeu5Ac二聚体Neu5Acα2→8Neu5Ac -Neu5Gc二聚体Neu5Gcα2→8Neu5Gc -Neu5Ac半乳糖Neu5Acα2→3(6)Gal -含Neu5Ac的双链N-型糖链 Neu5Acα2→3Gal -Neu5Acα2→6(Galβ→3)GalNAcol Neu5Acα2→6GalNAcol-人转铁蛋白 Neu5Acα2→6Gal -胎牛血清胎球蛋白Neu5Acα2→3(6)Gal -猪颌下腺粘蛋白 Neu5Acα2→6GalNAc -蟾蜍卵巢胶状糖蛋白 Neu5Acα2→6GalNAc -多聚乙酰神经氨酸(→8Neu5Acα2→)n-湖鳟鱼多糖蛋白 (→8Neu5Acα2→)n-虹鳟鱼多糖蛋白 (→8Neu5Acα2→)n-arctic char多糖蛋白 (→8Neu5Acα2→，→8Neu5Gcα2→)n-含Neu5Ac的神经节Neu5Acα2→3Gal -含NEu5Ac的神经节苷脂GM1 Neu5Acα2→3(GalNAcβ1→4)Gal -(2)最适pH使用上述获得的、本发明脱氨基神经氨酸酶的亲和纯化酶组份和单一纯化酶组份测定最适pH。除了使用0.1 M Tris-乙酸缓冲液作为缓冲液外，按照上述的4-MU-KDN法进行酶反应，在pH4.0至9.0范围内，在每个pH下进行酶反应，以测定每个pH条件下的酶活性。作为结果，图8(亲和纯化酶组份)和图9(单一纯化酶组份)显示，在pH6左右可获得最高的反应活性。(3)最适反应温度除了温度变化外，按照上述的4-MU-KDN法测定本发明脱氨基神经氨酸酶的活性。作为结果，本发明的脱氨基神经氨酸酶在25℃至30℃左右具有较高的反应活性。(4)稳定性将本发明的脱氨基神经氨酸酶在25℃和pH4至9条件下放置数小时。之后，按照4-MU-KDN法测定KDNase的活性。在这一pH范围内本发明脱氨基神经氨酸酶是相对稳定的。
将本发明脱氨基神经氨酸酶溶于0.1 M Tris-乙酸缓冲液(pH6.0)/0.1 M NaCl至70μg/ml的浓度，在不同温度下放置预定的一段时间。之后，按照4-MU-KDN法测定KDNase的活性。作为结果，在25℃下，本发明脱氨基神经氨酸酶至少48小时内不会失活。
无论pH或离子强度如何，本发明脱氨基神经氨酸酶在数十个μg/ml或稍低的浓度下是不稳定的。纯化了的酶可在存在蛋白如牛血清白蛋白时被稳定。(5)本发明脱氨基神经氨酸酶的抑制和活化为了研究诸如离子强度的EDTA(乙二胺四乙酸)对本发明脱氨基神经氨酸酶活性的影响，将这些化合物加入按照4-MU-KDN法进行酶反应的反应溶液中。作为结果，在这些用于研究的加入物浓度为1mM时，酶活性不受任何一种二价阳离子，即钙离子(Ca2+)、镁离子(Mg2+)、锰离子(Mn2+)，以及EDTA的影响。
研究了离子强度对本发明脱氨基神经氨酸酶活性的影响。结果见图10。当离子强度增加时，本发明脱氨基神经氨酸酶的活性迅速增加。在300mM NaCl时可得到最大的反应值。而在低离子强度50mM或者更低时，酶的活性极低。
本发明脱氨基神经氨酸酶可被游离的KDN(3mM)抑制，另外，本发明酶不被游离、作为KDN结构类似物的唾液酸所抑制。本发明脱氨基神经氨酸酶同样不被含有N-乙酰神经氨酸或N-乙二醇酰神经氨酸的复合多糖和糖类所抑制，已证明它们不是本发明脱氨基神经氨酸酶的底物。本发明脱氨基神经氨酸酶不被2，3-二羟基-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸所抑制。而2，3-二羟基-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸是已知的、可裂解N-酰基神经氨酸所形成酮苷键的唾液酸酶的特异性抑制剂。
本发明脱氨基神经氨酸酶不被作为表面活性剂的Triton X-100所抑制。存在有0.5％胆酸钠时，本发明脱氨基神经氨酸酶的活性基本消失，而在0.1％胆酸钠时，约有90％的酶活性得以保持。(6)(酶反应动力学的)Michaelis常数的测定在使用4-methylumbelliferyl KDN(4-MU-KDN)作为本发明脱氨基神经氨酸酶底物的条件下，测定了Michaelis常数(Km)和最大酶反应速度(Vmax)。在25℃下，将本发明脱氨基神经氨酸酶(32个百万单位)和底物(4-MU-KDN，4.7μM)于216μl的反应液(含有0.1mg/ml的牛血清白蛋白的0.1 Mtris-乙酸缓冲液(pH6.0)/0.1M NaCl)中反应。作为结果，在1小时内可线性释放4-methylumbelliferyl(4-MU)。
在25℃，正这一酶浓度下，在与上述相同的反应液中，4-MU-KDN的浓度改变为21至167μM，反应进行30分钟，以测定初反应速度。得到Lineweaver-Burk曲线，并由此计算Michaelis常数。作为结果，本发明脱氨基神经氨酸酶催化水解4-MU-KDN时的Vmax为0.19μM/min或者7.4mM/min/mg蛋白，Km为μM。(7)氨基酸分析使用6N盐酸，在105℃下水解24小时，以研究纯化了的KDNase(单一纯化酶)的氨基酸组成。结果如下，数字以摩尔百分率％表示。
天门冬酰胺和天门冬氨酸5.3谷氨酸5.5丝氨酸13.6甘氨酸19.8组氨酸2.0
精氨酸2.0苏氨酸6.7丙氨酸9.0脯氨酸3.5酪氨酸5.6缬氨酸5.9甲硫氨酸 7.6异亮氨酸 3.5亮氨酸4.0苯丙氨酸 3.2赖氨酸2.0实施例3合成含KDN的糖链将本发明脱氨基神经氨酸酶(1个单位)加入40mM KDN和40mM乳糖的混和溶液(50μl)，然后在25℃下于0.1 M Tris-乙酸缓冲液(pH6.0)中放置。作为结果，确定30分钟后在反应溶液中存在有含KDN的乳糖工业可应用性本发明的微生物可生产新的KDNase，该KDNase对于已知的、作为唾液酸酶作用点的N-酰基神经氨酸残基无反应活性。另外，该KDNase可作用于已知的唾液酸酶极难裂解的脱氨基神经氨酸残基，并且该KDNase可水解由脱氨基神经氨酸残基形成的酮苷键。
本发明的脱氨基神经氨酸酶有希望作为研究上有用的试剂，例如对脱氨基神经氨酸结构和功能的分析。本发明脱氨基神经氨酸酶对于KDN形成的酮苷键具有极高的特异性。因此，本发明脱氨基神经氨酸酶有希望用于检测KDN形成的酮苷键。
可使用本发明脱氨基神经氨酸酶进行水解反应的逆反应，以生成新的含脱氨基神经氨酸的复合多糖或糖类。这些新的含脱氨基神经氨酸的复合多糖或糖类可以作为类似物，从而有可能修饰含有N-乙酰神经氨酸的复合多糖或糖类，或者有希望用作新的生理活性物质。
权利要求
1.一种具有下列酶学性质的脱氨基神经氨酸酶(1)作用该脱氨基神经氨酸酶作用于含有脱氨基神经氨酸的复合多糖或糖类，并且水解由脱氨基神经氨酸形成的酮苷键(ketosidic linkage)，以生成游离的脱氨基神经氨酸和不含有脱氨基神经氨酸的复合多糖或糖类，或者部分去除脱氨基神经氨酸的复合多糖或糖类。(2)底物特异性该脱氨基神经氨酸酶作用于含有脱氨基神经氨酸的复合多糖或糖类，但不作用于含有N-乙酰神经氨酸或N-乙二醇酰神经氨酸复合或糖类中、由N-乙酰神经氨酸或N-乙二醇酰神经氨酸形成的酮苷键。
2.权利要求1的脱氨基神经氨酸酶，该酶具有以下的理化性质(i)最适反应pH；该脱氨基神经氨酸酶在pH6附近具有最适的反应pH值；(ii)稳定的pH范围在25℃下，该脱氨基神经氨酸酶在pH4至9范围内稳定；(iii)最适反应温度在25℃左右，该脱氨基神经氨酸酶具有最适的反应温度；(iv)热稳定性在25℃下，该脱氨基神经氨酸酶至少48小时不会失活；(v)抑制和稳定化作用该脱氨基神经氨酸酶被游离的脱氨基神经氨酸抑制，并且存在蛋白时，如牛血清蛋白，该脱氨基神经氨酸酶可被稳定。
3.权利要求1或2的脱氨基神经氨酸酶，该酶由SphingobacteriummOL 12-4s菌株产生。
4.一种用于生产脱氨基神经氨酸酶的方法，包括培养属于Sphingobacterium菌属并具有生产脱氨基神经氨酸酶能力的细菌，以及从所得培养物中收集该酶的步骤，该脱氨基神经氨酸酶由权利要求1所定义。
5.Sphingobacterium mOL 12-4s菌株具有生产脱氨基神经氨酸酶的能力。
6.一种用于生产含有脱氨基神经氨酸复合多糖或糖类的方法，包括权利要求1所定义的脱氨基神经氨酸酶与脱氨基神经氨酸和复合多糖和/或糖类进行共反应的步骤。
全文摘要
将属于Sphingobacterium菌属的一种菌、如Sphingobacterium mOL12-4S菌株，进行培养后从得到的培养物中收集菌，一种作用于含有脱氨基神经氨酸复合多糖或糖类的脱氨基神经氨酸酶，该酶可水解由脱氨基神经氨酸形成的酮苷键，以生成游离的脱氨基神经氨酸和不含有脱氨基神经氨酸的复合多糖或糖类，以及部分去除脱氨基神经氨酸的复合多糖或糖类，该脱氨基神经氨酸酶不作用于有关的、含有N-乙酰神经氨酸或N-乙醇酰神经氨酸复合多糖或糖类中、由N-乙酰神经氨酸或N-乙醇酰神经氨酸形成的酮苷键。
文档编号C12N1/20GK1156480SQ95194792
公开日1997年8月6日 申请日期1995年6月19日 优先权日1994年6月28日
发明者井上康男, 井上贞子, 北岛健 申请人:生化学工业株式会社