一株重组谷氨酸棒杆菌及其在生产5-氨基乙酰丙酸中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程和微生物代谢工程领域，具体地说，涉及一株重组谷氨酸棒 杆菌及其在生产5-氨基乙酰丙酸（5-ALA)中的应用。
【背景技术】
[0002] 5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid, 5-ALA)分子式为C5O3NH9，其分子量为 131. 13,熔点为118°C。5-ALA在农业上具有广泛的应用。研宄表明它是无公害的天然物 质，具有生物降解性，因此主要应用于绿色除草剂、植物生长调节剂、杀虫剂等方面。5-ALA 作为一种无公害的新型农药，由于其在环境中易降解，无残留，对哺乳动物无毒性，因而受 到越来越多的关注。另外，在医学领域，5-ALA作为一种安全、选择、渗透性好的光动力学药 物，已经应用于皮肤癌、膀胱癌、消化道癌、肺癌等的诊断与光动力治疗（PDT)中。
[0003] 目前，5-ALA主要是通过化学方法合成的。其化学合成主要集中在以马尿酸和琥 珀酸为原料的合成工艺研宄、以糠醛等杂环物质为原料的合成工艺研宄及以乙酰丙酸或其 衍生物为原料的合成工艺研宄。但是化学合成具有工艺步骤多、分离提纯难、副产物多、 5-ALA得率低等问题，从而造成生产成本高。除此之外，化学合成涉及很多有毒试剂，对环 境也会造成污染。所以随着社会和科学技术的发展，以廉价的可再生资源为底物，利用微生 物发酵生产5-ALA已是未来的趋势。目前市场上，葡萄糖价格为4500元/吨，5-ALA价格为 80000000元/吨。所以以廉价的葡萄糖作为原料发酵产5-ALA，成本上具有极大的优势，并 且还能减少对环境的污染，值得研发和推广。
[0004] 国外的一些文献报道，通过诱变育种法对光合细菌球形红细菌（Rhodobacter sphaeroides)诱变，能够筛选出5-ALA高产菌株，利用其发酵生产5-氨基乙酰丙酸，5-ALA 产量达到了 7. 2g/L。然而由于光合细菌发酵中采用光照，从而增加了成本，不适合大规模 工业发酵生产。随着基因工程技术的成熟，人们已经采用基因重组技术将R. sphaeroides 中的5-ALA合成酶基因（hemA)在野生型大肠杆菌中表达。Mariet和Zeikus获得大肠杆 菌（Escherichia coli)重组菌株，5-ALA发酵产量达到了 3. 79g/L。Xie等人利用含有 R. sphaeroides的5-ALA合成酶基因的重组大肠杆菌，经过发酵优化，5-ALA产量达到5. 2g/ L。2011年，Kang等人开始C5途径的研宄，他们将来自于亚利桑那沙门氏菌（Salmonella arizonae)的 hemA 基因（编码 glutamyl-tRNA reductase)突变后，与 hemL 基因（编码 glutamate-1-semi aldehyde aminotransferase)在 E. coli 中共表达，同时表达 了 一个由 rhtA基因编码的5-ALA转运蛋白，使得5-ALA的产量达4. 13g/L。在这些工艺研宄中所使 用的前提物质琥珀酸和甘氨酸主要是通过化学合成法制备，所以其生物转化5-ALA成本较 高，同时由于高浓度的甘氨酸（> I. 7g/L)能够造成对菌体生长的抑制，使生物转化工艺相 对复杂。另外，生物转化中所用的培养基为昂贵的LB培养基，这也成为5-ALA工业化的瓶 颈。所以如何降低发酵成本及简化发酵工艺，成为5-ALA工业生产的关键问题。
[0005] 同时，上述5-ALA生产方法主要采用的是模式菌株大肠杆菌，主要包括其C4-途 径，即通过表达5-ALA合成酶生物转化琥珀酸和甘氨酸来生产5-ALA，或者是利用大肠杆菌 的C5-途径，即表达外源的hemA和hemL基因以谷氨酸作为前提物质来生产5-ALA。既然 5-ALA的C5-合成途径的前提物质是谷氨酸，要是采用能天然生产谷氨酸并且具有安全性 的菌株谷氨酸棒杆菌（Corynebaererium glutamicum)的话，则可无需过多的考虑如何提高 上游代谢途径的谷氨酸产量的环节，这不仅能简化发酵工艺途径，还能大大降低发酵成本 以及设备支出，使工业生产5-ALA的成本显著下降；另外，谷氨酸棒杆菌广泛应用于食品发 酵，具有一定的安全性，利用谷氨酸棒杆菌发酵生产的5-ALA产品对进一步开发其医药价 值具有积极的作用。然而，经检索，关于重组谷氨酸棒杆菌及其构建和其在生产5-氨基乙 酰丙酸（5-ALA)中的应用的专利及文献还未见报道。
【发明内容】
[0006] 针对目前5-ALA生产中的缺陷，本发明要解决的问题是提供一株重组谷氨酸棒杆 菌及其在生产5-氨基乙酰丙酸（5-ALA)中的应用。
[0007] 本发明的技术方案是基于谷氨酸棒杆菌的C5途径，主要是在谷氨酸棒杆菌中过 量表达ALA的C5合成途径中协同表达的编码glutamyl-tRNA reductase突变体的基因 hemAM和 glutamate-1-semialdehyde aminotransferase 的基因 hemL，其中，hemA M来源于 亚利桑那沙门沙门氏菌，hemL来源于大肠杆菌，构建得到一株重组谷氨酸棒杆菌SEAL ;同 时还过量表达了来源于谷氨酸棒杆菌或沙门氏菌中的hemA基因及其突变体和来源于大肠 杆菌或谷氨酸棒杆菌中的hemL基因，并利用所构建的重组菌在无机盐培养基CGXII内以葡 萄糖作为唯一碳源来发酵生产5-氨基乙酰丙酸（5-ALA)。
[0008] 本发明所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，该重组谷氨酸棒杆菌命名为谷氨 酸棒杆菌SEAL，其基因型为：谷氨酸棒杆菌ATCC13032/pec-SthemAM-EchemL，由如下方法制 得：先克隆得到EchemL基因和突变基因 SthemAM，构建含SthemAM和EchemL基因的共表达 载体pec-SthemAM-EchemL，将所构建的重组质粒pec-SthemAM-EchemL电转入野生型谷氨酸 棒杆菌中，得到过量表达SthemAM和EchemL基因的重组谷氨酸棒杆菌，命名为谷氨酸棒杆 菌SEAL ;其中，所述EchemL基因来源于大肠杆菌，所述SthemAM是来源于亚利桑那沙门沙门 氏菌的hemA基因的突变体，所述表达SthemAM和EchemL基因的载体为穿梭质粒pECXK99E， 所述野生型谷氨酸棒杆菌是谷氨酸棒杆菌ATCC13032。
[0009] 本发明所述重组谷氨酸棒杆菌在发酵生产5-氨基乙酰丙酸中的应用。
[0010] 上述应用方法是：利用所述重组谷氨酸棒杆菌在无机盐培养基CGXII中发酵葡萄 糖来生产5-氨基乙酰丙酸；其中，
[0011] 所述无机盐培养基CGXII配方为：
[0012] 20g/L(NH4)2S04, 5g/L尿素，lg/L KH2PO4, lg/L K2HPO4, 0· 25g/L MgSO4 . 7H20, 42g/ L 3-吗啉丙磺酸，lOmg/L CaCl2, lOmg/L FeSO4 . 7H20, lOmg/L MnSO4 . H2O, lmg/L ZnSO4 .7H20,0.2mg/L CuS04,0 . 02mg/L NiCl2 . 6H20,0.2mg/L biotin, 40g/L 葡萄糖，0.03mg/L 柠檬酸钠，〇. 5mM IPTG，50 μ g/mL卡那霉素；
[0013] 所述发酵葡萄糖的发酵条件为：
[0014] 菌种接种量以体积百分比计为10±2%，发酵温度为30±l°C，pH为6. 5~7. 0,转 速为180±20rpm，发酵时间为108±2h。
[0015] 进一步的，发酵温度优选30°C，pH优选6. 5,转速优选180rpm，发酵时间为108h。
[0016] 本发明所述重组谷氨酸棒杆菌在生产5-ALA中的应用，具体方法是：
[0017] 摇瓶发酵：从LB平板上挑取谷氨酸棒杆菌SEAL单菌落接入50mL含有卡那霉素的 LB液体培养基中30°C，180rpm过夜培养。取适当体积的菌悬液4°C，12000rpm离心lmin， 收集菌体，并用无菌的生理盐水洗涤一次，用CGXII培养基重悬后接入含有40g/L葡萄糖的 CGXII培养基中30°C，180rpm进行5-ALA发酵，初始OD为0. 8-1. 0左右，IPTG浓度为0. 5mM， 每12h取样测定菌体浓度及5-ALA产量，然后利用比色法检测5-ALA的浓度，用4M无菌的 NaOH溶液调节pH至6. 5-7. 0之间，发酵时间为108 ±2h。
[0018] 5-ALA检测方法：将样品稀释至400 μ L，加入200 μ L的乙酸盐缓冲液，100 μ L的 乙酰丙酮，然后煮沸15mi