一种筛选高粘附肠道上皮细胞能力乳杆菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种筛选具有高粘附肠道上 皮细胞能力乳杆菌的方法。
【背景技术】
[0002] 乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB)是一类可以发酵糖类且主要产物为乳酸的 无芽孢革兰氏阳性细菌，对人类的营养与健康具有重要的意义，如：缓解乳糖不耐受症、改 善便秘和腹泻、维持肠道微生态平衡、增强免疫功能、影响心血管疾病的发展和缓解过敏反 应等。粘附是益生乳酸菌实现生理功能的重要先决条件，只有成功的粘附在宿主肠道上皮 细胞才可以为益生乳酸菌在粘膜表面的增殖提供竞争优势。从而通过大量的生长繁殖而实 现长期调节宿主的生理代谢和影响肠道环境的目的，进而改善宿主的营养与健康水平。因 此，粘附能力也是益生菌筛选的重要指标之一。
[0003] 因此，乳酸菌粘附机制也成为了乳酸菌的研宄热点之一。Camp等人（Infection and immunity，1985, 47 (1):332-334)在对双歧杆菌粘附的研宄中发现细胞壁脂磷壁 酸（LTA)与其粘附能力具有密切的联系。随后一些学者（Applied and environmental microbiology, 1994, 60(12):4487-4494 ；Applied and environmental microbiolo gy，2013, 79(15) :4576-4585)先后发现胞壁表面蛋白、胞外分泌型蛋白也与乳杆菌粘附肠 道上皮细胞有关。但这些研宄均基于已经得到了一株/几株高粘附肠道上皮细胞能力的 乳酸菌。目前，对于高粘附肠道上皮细胞能力乳酸菌的筛选主要停留在对已经筛选得到的 乳酸菌中，通过粘附模型测定候选菌株的粘附能力，进而筛选出粘附能力相对较高的乳酸 菌。这种方法不仅工作量大，而且只能从候选菌株中筛选出粘附能力相对较高的菌株，并不 能快速高效的筛选出一株/几株与现在商业生产菌株粘附能力相当，甚至更好的乳酸菌菌 株。因此，目前还需要一种有效的方法筛选获得高粘附肠道上皮细胞能力的乳酸菌。
【发明内容】
[0004] 本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施 方式。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本 部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
[0005] 鉴于上述和/或现有筛选高粘附肠道上皮细胞能力乳杆菌的方法中存在的问题， 提出了本发明。
[0006] 因此，本发明的目的是提供一种筛选具有高粘附肠道上皮细胞能力乳酸菌的方 法。
[0007] 为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种 筛选高粘附肠道上皮细胞能力乳杆菌的方法，其包括，将含盐浓度大于等于4%的自然发酵 食品置于带玻璃珠的生理盐水中，振荡30min，然后使用生理盐水按照体积比1:10进行连 续稀释，取1〇_5、1〇_6、1〇_7、1〇_8四个稀释梯度的菌液分别涂布在相应的选择培养基上涂布、 分离乳杆菌，分离得到的乳杆菌纯化菌株在30%灭菌甘油溶液中并在温度-80°C的条件下 冻存。
[0008] 作为本发明所述的筛选高粘附肠道上皮细胞能力乳杆菌的方法的一种优选方案， 其中：所述相应的选择培养基为添加4% NaCl及溴甲酚紫的MRS琼脂培养基。
[0009] 作为本发明所述的筛选高粘附肠道上皮细胞能力乳杆菌的方法的一种优选方案， 其中：所述振荡，是在80-100r/min的条件下振荡30min。
[0010] 本发明通过选择高盐浓度的自然发酵食品作为样品，从中分离得到了多个高耐 NaCl能力的乳杆菌，并通过大量多次试验研宄证明，分离得到的乳杆菌具有高粘附肠道上 皮细胞的能力，并且这种能力与其耐受NaCl的能力正相关。这对筛选益生乳酸菌，对其益 生功能的进一步开发，及商品产业化都提供了基础及有效途径。
【具体实施方式】
[0011] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面通过本发明的具体 实施方式做详细的说明。
[0012] 在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以 采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的 情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
[0013] 实施例1 :筛选乳杆菌
[0014] 1、样品米集
[0015] 原始样品采自邯郸涉县太行山脉附近和裕村、上马村等地农民自制的自然发酵泡 菜、酱菜及冬菜。用无菌三角瓶采集样品，采集得到的样品保存在温度〇°C的条件下，采样 48h内进行样品分析和乳酸菌的分离。
[0016] 2、从样品中分离乳酸菌
[0017] IOg样品置于带玻璃珠的90mL生理盐水中，振荡30min，然后使用生理盐水按照 体积比1:10进行连续稀释。使用本技术领域的技术人员熟知的涂布平板法，将10-5、10-6、 10'KT8四个稀释梯度的菌液0.1 mL分别涂布在以下三种培养基平板上：含有NaCl浓度为 4%及添加溴甲酚紫指示剂的MRS培养基（用于培养乳杆菌的培养基），37°C培养48h。从 长有30-300个菌落的平板上分离单个菌落，用接种环随机挑取其中的5-10个菌落在4% NaCl的MRS液体培养基中，并在在相应的温度下培养24h，然后在4% NaCl的MRS固体平板 上划线。分离物连续划线三次得到纯的单菌落，然后进行本技术领域的技术人员熟知的革 兰氏染色与接触酶试验。将革兰氏染色阳性、接触酶实验为阴性的菌株接入MRS液体培养 基中，37°C静置培养24h，然后按照以培养基重量计2-4%接种量分别接种于MRS液体培养 基中，37°C静置培养18-24h进行活化，连续转接3次，得到活性良好的乳酸菌。其纯化菌株 于30%灭菌甘油溶液中在温度-80°C的条件下冻存。
[0018] 利用添加4% NaCl及溴甲酚紫的MRS琼脂培养基上共分离出146个分离株。经 过菌落形态、革兰氏染色、接触酶试验排除了 5个革兰氏阴性，3个接触酶阳性和6个酵母。 这样，分离纯化后得到了 132株乳杆菌。
[0019] 实施例2 :筛选得到的乳酸菌耐盐实验
[0020] 将_80°C甘油管保存的乳酸菌分别在MRS固体平板上划线，37°C倒置培养至长出 单菌落；挑单菌落接种到MRS液体培养基，37°C静置培养12h后连续转接3次后即为预培养 液。
[0021] 上述制备的预培养液以2%接种量分别接种于盐浓度分别为4%、6%、8%、10% NaCl及不含有NaCl的MRS液体培养基中，37°C静置培养，每2h测一次吸光值，根据吸光值 绘制生长曲线。根据监测在不同NaCl浓度下乳杆菌的生长曲线发现，分离纯化得到的132 乳杆菌的NaCl耐受能力均大于等于4%，其中有21株乳杆菌耐受NaCl的能力高达10%。
[0022] 表1部分乳酸菌的耐盐能力
[0023] Table I Ability of partly LAB to salt tolerance
[0024]
[0025] I)同一列不同的小写字母分别代表差异显著（p < 0. 05)。
[0026] 实施例3 :筛选得到的乳酸菌粘附肠道上皮细胞HT-29的能力
[0027] 1、细胞的复苏、培养与冻存
[0028] 将HT-29细胞冻存管快速放入37°C水浴锅中，溶化后800rpm离心5min，去上清 后用新鲜的培养液重悬细胞，使其均匀分散于培养瓶中，在5% 0)2和95%空气的气体条 件下37°C进行培养，复苏时每48h更换培养液1次。待细胞生长良好时（70%融合），用胰 酶-EDTA溶液对HT-29细胞在温度为37°C的条件下进行消化，1:3分瓶培养。冻存时在完 全培养液中加入10%亚甲基二楓（DMSO)，液氮保存。粘附实验时将细胞消化后调整细胞浓 度为2 X IO5个/mL，接种于含有盖玻片的6孔板中培养至细胞长至融合度达80 %。
[0029] 2、粘附实验
[0030] 5000rpm离心5min收集在相应培养基中生长的菌体；用生理盐水洗涤菌体3次后 重悬菌体，并调节菌体浓度为IO8CFUAiL ;将上述菌悬液2mL加入含有长至单层的HT-29细 胞盖玻片的6孔板中，于5% 0)2培养箱中37°C孵育2h ;孵育后用无菌PBS洗涤3次；0. 4% 多聚甲醛固定0. 5h后革兰氏染色。
[0031] 3、粘附观察及计数
[0032] 染色后，在油镜下观察细菌粘附的情况，并拍照。显微镜观察时每个盐浓度下随机 取20个视野内大约100个细胞，计算细胞所粘附的细菌数，每个细胞上平均被粘附的细菌 数即为粘附指数，每个盐浓度做三个重复，实验重复3次后进行数据分析。
[0033] 由表1可以看出，根据本说明书所述方法分离纯化得到的乳酸菌的粘附能力与其 耐受NaCl的能力正相关，且根据本说明书所述方法分离纯化得到的乳酸菌的粘附能力均 与本实验所用商业对照菌株相当甚至高于对照菌株（相同耐受NaCl的菌株之间比较）。
[0034] 采用本发明方法分离得到的乳杆菌，其具有下述性质：
[0035] (1)具有耐盐性，耐受NaCl能力均超过6% ;
[0036] (2)具有尚粘附能力，且粘附肠道上皮细胞的能力与耐受NaCl能力正相关。
[0037] 应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳 实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术 方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发 明的权利要求范围当中。
【主权项】
1. 一种筛选高粘附肠道上皮细胞能力乳杆菌的方法，其特征在于：包括， 将含盐浓度大于等于4%的自然发酵食品置于带玻璃珠的生理盐水中，振荡，然后使用 生理盐水按照体积比1:10进行连续稀释，取1〇_5、1〇_6、1〇_7、1〇_ 8四个稀释梯度的菌液分别 涂布在相应的选择培养基上涂布、分离乳杆菌，分离得到的乳杆菌纯化菌株在30%灭菌甘 油溶液中并在温度_80°C的条件下冻存。2. 根据权利要求1所述的筛选高粘附肠道上皮细胞能力乳杆菌的方法，其特征在于： 所述相应的选择培养基为添加4%NaCl及溴甲酚紫的MRS琼脂培养基。3. 根据权利要求1所述的筛选高粘附肠道上皮细胞能力乳杆菌的方法，其特征在于： 所述振荡，是在80-100r/min的条件下振荡30min。
【专利摘要】本发明公开了一种筛选高粘附肠道上皮细胞能力乳杆菌的方法，其包括，将含盐浓度大于等于4％的自然发酵食品置于带玻璃珠的生理盐水中，振荡，然后使用生理盐水按照体积比1:10进行连续稀释，取各个稀释梯度的菌液分别涂布在相应的选择培养基上涂布、分离乳杆菌，分离得到的乳杆菌纯化菌株在30％灭菌甘油溶液中并在温度-80℃的条件下冻存。本发明对筛选益生乳酸菌，对其益生功能的进一步开发，及商品产业化都提供了基础及有效途径。
【IPC分类】C12Q1/04, C12N1/20, C12R1/225
【公开号】CN104928218
【申请号】CN201510385193
【发明人】赵山山, 郝光飞, 江利华, 林冬梅, 王斌, 张振国
【申请人】河北工程大学
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年6月30日