一种均相酶解纤维素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种在NaOH/尿素/纤维素均相体系下，聚乙二醇马来酰亚胺修饰纤 维素酶均相酶解纤维素及其温控分离的方法。
【背景技术】
[0002] 纤维素是全球再生量最大的生物质资源，每年生物合成量超过500亿吨。纤维素 高值化利用的关键在于如何使其高效降解成单糖，进而可以转化成用途广泛的重要化学品 或燃料。因此从长远考虑，实现纤维素高效转化成单糖是解决化石资源日益减少所带来的 全球资源危机的有效途径之一。
[0003] 目前纤维素降解方法包括物理法、化学法和生物法，其中生物法是指利用纤维素 酶对纤维素中0 -糖苷键进行特异性水解，从而制得糖类化合物的一种有效方法，具有对 环境友好，能耗低，副产物少等优点，被认为是最具应用前景的转化途径。但是，由于纤维 素是线性长链高分子聚合物，其分子中的羟基易和分子内或相邻分子上的含氧基团形成强 氢键作用，使纤维素分子共同组成结晶结构，该结构使纤维素显示出刚性和高度水不溶性， 大大减弱了纤维素酶对纤维素的可及性，导致纤维素的转化率低，酶解周期长，成本高。因 此，需要寻找对纤维素有高效溶解能力的溶剂，以瓦解纤维素的这种高度结晶结构，有利于 纤维素酶与纤维素的有效接触，促进其酶解。目前，对纤维素具有良好溶解能力的溶剂有 N-甲基吗啉-N-氧化物（NMM0)、氯化锂/二甲基乙酰胺（LiCl/DMAc)体系、氨基甲酸酯体 系和离子液体等，这些溶剂在不同程度上存在着价格高、溶解条件苛刻、易挥发、回收困难、 所得溶液粘稠等问题，极大地限制了纤维素的应用。2005年武汉大学的张俐娜老师开发了 新一类溶解纤维素的溶剂体系，NaOH/尿素、NaOH/硫脲、LiOH/尿素水溶液体系，其中NaOH/ 尿素体系以其廉价和高效的溶解性能成为大家关注的热点。采用7wt%NaOH/12wt%尿素 水溶液预冷至-12°C，它能迅速溶解纤维素（重均分子量Mw为1. 2X105)得到透明的溶液 (5min内完全溶解）。该纤维素溶液在0~5°C的范围内能够长时间保持稳定的溶液态（约 1周）。这种新溶剂体系采用了最经济、最普通的化工原料，且所用的化学原料容易回收， 可循环使用，因此该体系被认定是新一代无污染的绿色纤维素新溶剂。在该体系下，溶剂 小分子更易与纤维素上的-0H基团结合形成新的氢键网络从而破坏纤维素原有的分子内 和分子间氢键，使得纤维素在小分子溶剂的包合下，以链状形式均匀分布于水中，得到透明 的纤维素溶液。若能在该体系下实现均相酶解，同时反应后将纤维素酶分离出来，进行循环 利用，那么富含还原糖的NaOH/尿素体系就可通过pH的调节以适应后期发酵生产。可以设 想，按照以上的研宄思路，一个高效绿色的纤维素利用体系将被建立。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是创制具有高效高稳温敏的纤维素酶，以实现在NaOH/尿素体系下 纤维素的均相酶解及纤维素酶的有效回收。
[0005] 本发明的技术方案是这样实现的：将7wt%NaOH/12wt%尿素水溶液预冷 至-12°C，然后加入微晶纤维素，得到均相溶液，pH值为13. 98,纤维素占溶剂的重量比 5-10%。在30°C下加入修饰纤维素酶，加入量为每毫升溶剂0. 5_5mg，反应1小时，纤维素 转化成还原糖的转化率在70-80%。反应结束后，体系降温到-10°C，修饰酶主动从反应体 系中析出，可直接回收利用。
[0006] 本发明采用的修饰纤维素酶是这样得到的：在30-35°C下，在柠檬酸-磷酸氢二钠 缓冲溶液（pH= 7.0)中，加入天然纤维素酶，待其完全溶解后，缓慢加入等质量的分子量 20000聚乙二醇马来酰亚胺，混合均匀后，恒温反应3小时，停止反应，通过透析纯化得到修 饰纤维素酶，标记为Cell-Mal20k。
[0007] 本发明采用的纤维素酶，酶活力：180〇11/毫克，最佳口11:4.8，最佳温度50°〇。
[0008] 本发明采用微晶纤维素原料的分子量2. 5~5万，聚合度153~300,灰分 < 0? 6%，粒径 25 ~190ym。
[0009] 发明效果
[0010] 本发明提供的新型修饰纤维素酶，能在强碱性NaOH/尿素体系下表现出良好的活 性和稳定性及温敏性，很好地促进纤维素降解，并可高效回收纤维素酶。使用本发明的方法 可提高天然纤维素酶抵制环境引起酶失活的能力，从而提高了酶的催化活性，在反应过程 中始终保持较高的催化活性，并可实现酶的高效回收和重复使用，具有明显的先进性，将为 纤维素资源的综合利用提供一条新的途径。
【具体实施方式】
[0011] 以下结合实施例进一步说明，并非限制本发明所涉及的范围。
[0012] 实施例1 :
[0013] 微晶纤维素原料：分子量2. 5~5万，聚合度153~300,灰分< 0. 6%，粒径25~ 190um〇
[0014] 还原糖量的测定方法
[0015] DNS试剂：1. 6gDNS和21gNaOH，加入到200mL水中溶解，185g酒石酸钾钠溶于 500mL水中，与上溶液混合加入5g结晶酚，5g无水亚硫酸钠搅拌溶解，冷却定容于1000mL 容量瓶，储于棕色瓶中7-10天后使用。
[0016] 葡萄糖标准曲线：将葡萄糖在105°C下烘干2h至恒重，精确称取0.lg用蒸馏水 溶解，并定容到l〇〇mL此浓度为1. 0mg/mL。取10支20mL的具塞刻度试管，依次加入OmL、 0. 2mL、0. 4mL、0. 6mL、0. 8mL、1.OmL、1. 2mL、1. 4mL、1. 6mL、1. 8mL葡萄糖标准溶液，然后每支 试管中加入蒸馏水，总体积为2.OmL，再分别加入0. 5mLDNS试剂，摇均后在沸水中准确放 置5min，取出用流水迅速冷却，用蒸馏水定容至20mL，充分摇均后静置20min。最后在波长 540nm处测各比色管中溶液的吸光值A，以吸光值作纵坐标，相应葡萄糖浓度C(mg/mL)作横 坐标，得到葡萄糖标准曲线。
[0017] 在装有温度计、冷凝管和转子的50mL三口瓶中加入15mLpH= 7. 00. 1M的现配柠 檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；设定水浴加热温度为35°C，待瓶内温度稳定后加入150mg纤 维素酶粉末，缓慢搅拌溶解；称取150mg分子量20000的单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺作为 修饰剂，并开始计时，混合均勾；反应3h后，反应液通过透析袋（截留20k大分子）在pH= 4. 80. 1M的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中透析过夜；得到纯化修饰纤维素酶液，冻干得到修 饰纤维素酶粉。记作Cell-Mal20k，4°C下保存。
[0018] 称取7. 5g7wt%NaOH/12wt%尿素水溶液于100mL三口瓶中，降温到-12°C，加入 375mg微晶纤维素（5 %w/w)溶解5分钟，得到均相溶液，体系pH值13. 98。在此均相溶液 中加入15.Omg的Cell-Mal20k，30°C下反应1小时后，取0. 5mL反应酶液，加入1. 5mLDNS 试剂，沸水终止反应显色5min，冰水冷却至室温，蒸馏水定容至20mL。在540nm下测定吸光 度值，代入标准葡萄糖曲线，得到还原糖量达到4. 25mg/mL，纤维素转化为还原糖的转化率 为70%。反应结束后，体系降温到-10°C，修饰酶自动从体系中析出，经离心后回收，无需任 何处理，直接回用。
[0019] 实施例2 :
[0020]微晶纤维素原料：分子量2. 5~5万，聚合度153~300,灰分< 0. 6%，粒径25~ 190um〇
[0021] 还原糖量的测定方法和修饰酶的制备方法：参见实施例1。
[0022] 称取7. 5g7wt%NaOH/12wt%尿素水溶液于100mL三口瓶中，降温到-12°C，加入 450mg微晶纤维素（6 %w/w)溶解5分钟，得到均相溶液，体系pH值13. 98。在此均相溶液 中加入15.Omg的Cell-Mal20k，30°C下反应1小时后，取0. 5mL反应酶液，加入1. 5mLDNS 试剂，沸水终止反应显色5min，冰水冷却至室温，蒸馏水定容至20mL。在540nm下测定吸光 度值，代入标准葡萄糖曲线，得到还原糖量达到4. 37mg/mL，纤维素转化为还原糖的转化率 为72%。反应结束后，体系降温到-10°C，修饰酶自动从体系中析出，经离心后回收，无需任 何处理，直接回用。
[0023] 实施例3 :
[0024]微晶纤维素原料：分子量2. 5~5万，聚合度153~300,灰分< 0. 6%，粒径25~ 190um〇
[0025] 还原糖量的测定方法和修饰酶的制备方法：参见实施例1。
[0026] 称取7. 5g7wt%NaOH/12wt%尿素水溶液于100mL三口瓶中，降温到-12°C，加入 600mg微晶纤维素（8 %w/w)溶解5分钟，得到均相溶液，体系pH值13. 98。在此均相溶液 中加入35.Omg的Cell-Mal20k，30°C下反应1小时后，取0. 5mL反应酶液，加入1. 5mLDNS 试剂，沸水终止反应显色5min，冰水冷却至室温，蒸馏水定容至20mL。在540nm下测定吸光 度值，代入标准葡萄糖曲线，得到还原糖量达到4. 55mg/mL，纤维素转化为还原糖的转化率 为75%。反应结束后，体系降温到-10°C，修饰酶自动从体系中析出，经离心后回收，无需任 何处理，直接回用。
[0027] 实施例4 :
[0028] 微晶纤维素原料：分子量2. 5~5万，聚合度153~300,灰分< 0. 6%，粒径
[0029] 25 ~190ym。
[0030] 还原糖量的测定方法和修饰酶的制备方法：参见实施例1。
[0031] 称取7. 5g7wt%NaOH/12wt%尿素水溶液于100mL三口瓶中，降温到-12°C，加入 600mg微晶纤维素（8 %w/w)溶解5分钟，得到均相溶液，体系pH值13. 98。在此均相溶液 中加入40.Omg的Cell-Mal20k，30°C下反应1小时后，取0. 5mL反应酶液，加入1. 5mLDNS 试剂，沸水终止反应显色5min，冰水冷却至室温，蒸馏水定容至20mL。在540nm下测定吸光 度值，代入标准葡萄糖曲线，得到还原糖量达到4. 85mg/mL，纤维素转化为还原糖的转化率 为80%。反应结束后，体系降温到-10°C，修饰酶自动从体系中析出，经离心后回收，无需任 何处理，直接回用。
[0032] 实施例 5-11:
[0033] 实验条件与步骤同实施例1，只是将修饰酶改为实施例1中回收的修饰酶，进行六 次重复回用实验，回用结果见表1。
[0034] 表1修饰酶的重复回用结果
[0035]
【主权项】
1. 一种均相酶解纤维素的方法，其特征在于以分子量为20000单甲氧基聚乙二醇马 来酰亚胺为修饰剂，定点修饰市售纤维素酶的巯基，制得修饰纤维素酶，标记为Cell-Mal 20k ;用合成的修饰酶Cell-Mal 20k在氢氧化钠/尿素水溶液中均相酶解纤维素，反应温度 30°C，反应时间lh，体系pH值13. 98,反应结束后，冷却至-10°C，Cell-Mal 20k与产物相 分层，分别回收Cell-Mal 20k和产物相，Cell-Mal 20k无需处理，可直接循环使用。
【专利摘要】本发明公开了一种均相酶解纤维素的方法，以分子量为20000单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺为修饰剂，定点修饰市售纤维素酶的巯基，制得修饰纤维素酶，标记为Cell-Mal 20k；用合成的修饰酶Cell-Mal 20k在氢氧化钠/尿素水溶液中均相酶解纤维素，反应温度30℃，反应时间1h,体系pH值13.98，反应结束后，冷却至-10℃，Cell-Mal 20k与产物相分层，分别回收Cell-Mal 20k和产物相，Cell-Mal 20k无需处理，可直接循环使用。本发明的特点在于所制备的修饰纤维素酶稳定性高且具有温敏性，在强碱性的氢氧化钠/尿素水溶液中仍能保持高的活性和温控性，实现了酶的高效回收和重复使用，为纤维素提供了一条高效酶解的新途径。
【IPC分类】C12N9-96, C12P19-14, C12P19-02, C12N9-42
【公开号】CN104830926
【申请号】CN201410817928
【发明人】李露, 于世涛, 刘仕伟, 刘福胜, 解从霞
【申请人】青岛科技大学
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2014年12月25日