一种用于检测mers的荧光rt-pcr引物、探针和试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于体外核酸检测领域，本发明提供了一种用于检测临床样品中中东呼吸 综合征冠状病毒（MiddleEastRespiratorySyndrome，MERS)的荧光RT-PCRRT-PCR引物 和探针和试剂盒及检测方法，可用于中东呼吸综合征冠状病毒的临床早期诊断。 技术背景
[0002] 2012年9月首次报告了 2例临床表现类似于SARS的新型冠状病毒感染病例。2013 年5月23日，世界卫生组织（WHO)将这种新型冠状病毒感染疾病命名为"中东呼吸综合 征"（MiddleEastRespiratorySyndrome，MERS)。自 2012年 9 月至 2015年 5 月 25 日， 全球共有24个国家累计报告MERS确诊病例1139例，431人死亡，病死率37. 8%。其中，沙 特病例集中地区，截至当日，沙特累计报告MERS确诊病例1005例，死亡440人，占全球累计 报告病例数的88. 2%，病死率43. 8%。2015年5月28日，我国发现并确诊了首例输入性中东 呼吸综合征感染病例，之前的研宄表明，MERS的传染性很有限，但是随着近期韩国国内方面 首次确诊了三次感染患者，表明该病毒可能已经具备了持续的人传人能力，疫情风险进一 步加大，同时由于我国与中东地区存在商务、宗教交流、旅游等一定规模人员往来，存在疫 情进一步的输入风险。
[0003] 中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV)属于冠状病毒科，|3类冠状病毒的2c亚 群，是一种具有包膜、基因组为线性非节段单股正链的RNA病毒。病毒粒子呈球形，直径 为120-160nm。基因组全长约30kb。目前已经完成多株MERS-CoV的全基因组序列测定， 从基因组序列分析，MERS-CoV与SARS基因组相似性为55%左右。2014年分别从沙特地 区一个MERS-CoV感染病人及其发病前接触过的单峰骆驼体内分离出基因序列完全相同的 MERS-CoV，同时在埃及、卡塔尔和沙特其他地区的骆驼中也分离到和人感染病例分离病毒 株相匹配的病毒，并在非洲和中东的骆驼中发现MERS-CoV抗体，因而骆驼可能是人类感染 来源。但不排除蝙蝠或其他动物也可能是中东呼吸综合征冠状病毒的自然宿主。
[0004]目前尚无明确有效的抗中东呼吸综合征冠状病毒药物，因此控制疫情的进一步发 展主要靠及时的发现和隔离。
[0005] 实时荧光PCR技术，通过引入特异性探针和荧光信号的动态监测使PCR产物的扩 增及分析的全过程可以在单管内封闭完成，并且可以对PCR扩增产物进行实时动态监测及 自动分析结果，具有实时、准确、快速、简便等特点，是一种先进的分子检测技术。
【发明内容】
[0006] 本发明目的是提供一种用于多重实时荧光RT-PCR技术检测中东呼吸综合征冠状 病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针，及包括该荧光RT-PCR引物和荧光探针的试剂盒和使 用该荧光RT-PCR引物和荧光探针对中东呼吸综合征冠状病毒的检测方法，该检测方法可 以快速、定性检测临床样本中的中东呼吸综合征冠状病毒。
[0007] 为实现上述目的，本发明的技术方案是针对于中东呼吸综合征冠状病毒两个不同 的基因编码区的特异保守区域为靶标区域，设计两对特异性引物及荧光探针，同时设置了 内标质控系统，用于整的核酸提取和反应体系的质量控制。内标靶区选取与中东呼吸综合 征冠状病毒第一对保守目标区域一致，并在探针位置人工合成一段寡核苷酸，再根据该寡 核苷酸设计特异性荧光探针，与任何物种均无交叉反应。
[0008] -种用于检测中东呼吸综合征冠状病毒（MERS)的荧光RT-PCR引物和荧光探针， 引物和荧光探针包括第一对和第二对引物和荧光探针，所述第一对和第二对引物和荧光探 针为分别针对中东呼吸综合征冠状病毒两个不同基因的保守序列设计的第一对和第二对 特异性正反向引物和荧光探针。
[0009] 作为本发明的进一步改进，所述第一对正向、反向引物和荧光探针序列分别是： 正向引物：5' -CCAACTAAGAAACTGCGCTACGT-3' 反向引物：5' -TGTAACCCTGACATAGTGTGITGGT-3' 寡核苷酸探针：5' -AGCGTAGAITITCTCTTCTGCGCCCTGAA-3' ； 所述第二对正向、反向引物和荧光探针序列如下： 正向引物：5' -ITGCGTGATTAITTAGCTGACTATGAC-3' 反向引物：5' -TCCTGTACCACCAACATTAATAGCA-3' 寡核苷酸探针：5' -TCACTGCCGGCCCAITCATGG-3' ； 上述第一对荧光探针和第二对荧光探针的3'端标记有荧光淬灭基团，5'端分别标记 有不同的荧光报告基团。
[0010] 上述引物和探针的衍生序列也为本发明的保护范围，所述衍生序列包括引物序列 的互补链序列，同时还可以向5'端和3'端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基 得到的序列。
[0011] 一种Taqman探针法荧光RT-PCR检测中东呼吸综合征冠状病毒的试剂盒，其包 含RT-PCR反应液、酶混合液、内标溶液、阴性质控品、阳性质控品、弱阳性质控品，其中 RT-PCR反应液主要是dATP、dUTP、dGTP、dCTP等四种核苷酸、用于检测中东呼吸综合征冠状 病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针以及内标探针、含有镁离子的缓冲液组成。其中试剂盒 内标寡核苷酸探针序列如下： 寡核苷酸探针：5' -ACGACTCCTCGCCTTCGGCTCATC-3'，该探针的5'端标记有与第一对 荧光探针和第二对荧光探针5'端标记的荧光报告基团均不同的荧光报告基团，3'端标记 有荧光淬灭基团； 作为本发明的进一步改进，所述荧光报告基团选自FAM、J0E或R0X;所述荧光淬灭基 团为BHQ。
[0012] 作为本发明的进一步改进，所述荧光报告基团选自TET、TAMRA、HEX、VIC、CY3、CY5 或TexasRed;所述焚光淬灭基团选自TAMRA、Eclipse、Dabcyl、LowaBlack?RQ或Lowa Black?FQ〇
[0013] 其中所述的酶混合液为包含有热启动的TaqDNA聚合酶、M-MLV逆转录酶、RNA酶 抑制剂（RNasin)的缓冲液。
[0014] 其中所述的内标溶液为含有内标区域选取与中东呼吸综合征冠状病毒第一对保 守目标区域一致，并在探针位置人工合成一段多核苷酸的内标质粒。
[0015] 其中所述的阳性质控品为含插入中东呼吸综合征冠状病毒特异性保守序列的质 粒载体，该重组质粒转化到大肠杆菌DH5a中增殖后经提取纯化用分光光度计测定浓度和 纯度后用无菌TE缓冲液稀释。其中阳性质控品的浓度为1.OX106c〇pies/ml。
[0016] 其中所述的阴性质控品为无菌TE缓冲液，该缓冲液采用DEPC水配制。
[0017] 本试剂盒保存于_20°C，尽量减少反复冻融。
[0018] 一种用于检测中东呼吸综合征冠状病毒的荧光RT