Pg-rca检测ev71的引物组及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测肠道病毒71型（EV71)的引物组及检测方法，特别涉及PG-RCA检 测EV71的引物组及检测方法。
【背景技术】
[0002] 肠道病毒71型（enterovirus71，EV71)是小RNA病毒科、肠道病毒属成员，是引 起婴幼儿手足口病（hand-foot-mouthdisease，HFMD)的主要病原体，对中枢神经系统有极 高的感染性，重症患者比例明显高于其他肠道病毒，在世界范围内已引起10余次的爆发和 流行。
[0003] 常规的EV71诊断技术包括免疫学方法、病毒分离培养、PCR方法等，但大多存在难 以早期诊断或敏感性或特异性低等缺陷。
[0004] 肠道病毒的传统检测方法为先将病毒分离培养，然后进行血清中和试验定型分 类，此法繁琐、耗时、费力，虽然多数培养结果可在1周内得到，但中和试验却十分费时、昂 贵，甚至有时无法定型。
[0005] PCR方法具有快速、敏感性强、特异性高等诸多优点，已应用于肠道病毒的检测，但 常规检测EV71RNA的RT-PCR方法需要精密的实时荧光PCR仪，对操作分析人员技术要求 较高，且需逆转录及PCR两个实验才能完成检测，因而使其不适用于现场快速检测及基层 普及应用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种PG-RCA检测EV71的引物组及检测方法，适用于现场快 速检测及基层普及应用，能够快速、高效的检测EV71。
[0007] 为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种PG-RCA检测EV71的引物 组，包括：
[0008] 引物模板T:
[0009] TGCTCAAGGTGTGTGAATGCTTTTTCATAATCTGAGGGCTCTGCTCACGCTATCTTTTT；
[0010] 引物P:GGTGCTGGTAGAGCGTGAGGATTATG;以及
[0011] 环状探针CP前体：
[0012] GCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATGCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATGCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATo
[0013] 相应地，本发明还提供了应用上述PG-RCA检测EV71的引物组检测EV71的方法， 包括以下步骤：
[0014] (1)提取待检测样品中的病毒RNA;
[0015] (2) 0. 5yL的所述病毒RNA、引物模板T、引物P、1XVent(exo_)DNA聚合酶缓冲液 补足5yL，80°C变性3min，37°C退火；
[0016] (3)然后加入5yL的PG-RCA反应体系，60°C恒温扩增，监测反应荧光强度2~3小 时，得出检测结果，其中，PG-RCA反应体系包含：dNTP、环状探针CP、0. 05UVent(ex〇-)DNA 聚合酶、1UNb.BsmI(切割酶的一种）、SYBRGreenI(染料）、lXVent(ex〇-)DNA聚合酶缓 冲液补足5yL。
[0017] 在一些实施方式中，在步骤（2)中，变性反应前，引物模板T和引物P的终浓度为 lnM〇
[0018] 在一些实施方式中，在步骤（3)中，dNTP终浓度为0. 8mM，环状探针CP终浓度为 15nM。
[0019] 本发明的有益效果为：本发明的引物模板T、引物P以及环状探针CP根据EV71 VP1基因区保守序列设计，建立了三向连接构造（Three-wayjunctionformation，3WJ) 组合引物介导的滚环扩增技术（Primergeneration-rollingcircleamplification， PG-RCA)技术用于检测EV71的方法，能检测到amol(10_18mol)级的EV71合成RNA，检测临 床标本时特异性强、敏感度好。
[0020] 本发明的检测方法具备如下优点：
[0021] 1、PG-RCA反应前一次加完所有试剂，操作简单步骤少；
[0022] 2、本检测方法只需一个恒温设备和一个信号收集设备，在实验中仅利用了实时荧 光PCR仪的恒温及收集荧光的功能，使检测操作简单；
[0023] 3、本检测方法在检测过程中不需打开试管盖，扩增的单链引物片段易降解，在很 大程度上降低PCR过程中的污染概率。
[0024] 因此，本检测方法操作简单、快速、高效，适合各个层面的卫生医疗单位普及应用。
【附图说明】
[0025] 图1为本发明的实施例1中15%聚丙烯酰胺凝胶电泳成像；
[0026] 图2为本发明的实施例2中PG-RCA检测EV71的方法的灵敏度测试结果图；
[0027] 图3为本发明的实施例2中PG-RCA检测EV71的原理图；
[0028] 图4为本发明的实施例3中PG-RCA检测EV71的方法检测临床样本的结果图。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。
[0030] 实施例1
[0031] (1)引物模板、引物及探针的设计。
[0032]在NCBI((NationalCenterforBiotechnologyInformation，是指美国国立生 物技术信息中心）搜索20个EV71VP1基因序列。对上述20条序列进行比对，在其保守区 选取50碱基的保守序列作为靶序列，命名为RNA71，同时根据RNA71序列PrimerPremier 5软件设计引物模板T、引物P以及环状探针CP前体。RNA71、引物模板T、引物P序列见表 1〇
[0033] 表 1
[0034]
【主权项】
1. PG-RCA检测EV71的引物组，其特征在于，包括： 引物模板T : TGCTCAAGGTGTGTGAATGCTTTTTCATAATCTGAGGGCTCTGCTCACGCTATCTTTTT ； 引物 P:GGTGCTGGTAGAGCGTGAGGATTATG;以及 环状探针CP : GCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATGCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATGCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATo
2. 应用权利要求1所述PG-RCA检测EV71的引物组检测EV71的方法，其特征在于，包 括以下步骤： (1) 提取待检测样品中的病毒RNA ; (2) 0. 5 y L的所述病毒RNA、引物模板T、引物P、I X Vent (exo-) DNA聚合酶缓冲液补足 5yL，80°C变性 3min，37°C退火； (3)然后加入5yL的PG-RCA反应体系，60°C恒温扩增，监测反应荧光强度2~3小时， 得出检测结果，其中，PG-RCA反应体系包含：dNTP、环状探针CP、0. 05UVent(ex〇-)DNA聚合 酶、IUNb.BsmI、SYBRGreenI、IXVent(exo_)DNA聚合酶缓冲液补足5yL0
3. 根据权利要求2所述的PG-RCA检测EV71的引物组检测EV71的方法，其特征在于， 在步骤（2)中，变性反应前，所述引物模板T和引物P的终浓度为InM。
4. 根据权利要求2所述的PG-RCA检测EV71的引物组检测EV71的方法，其特征在于， 在步骤（3)中，所述dNTP终浓度为0. 8mM，所述环状探针CP终浓度为15nM。
【专利摘要】本发明公开了一种PG-RCA检测EV71的引物组及检测方法。引物模板T、引物P以及环状探针CP根据EV71VP1基因区保守序列设计，建立了3WJ组合PG-RCA技术用于检测EV71的方法，能检测到amol(10-18mol)级的EV71合成RNA，检测临床标本时特异性强、敏感度好。检测方法操作简单、快速、高效，适合各个层面的卫生医疗单位普及应用。
【IPC分类】C12Q1-70, C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104846123
【申请号】CN201510247029
【发明人】张宏萍, 陆仁飞
【申请人】张宏萍
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年5月14日