B液体培养基，37摄氏度下150转每分钟培 养60分钟，取100微升培养液涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37摄氏度培养16 小时后获得单转化菌落，挑取单转化菌落进行测序验证。
[0054] 基因正向测序结果见图3-6
[0055] pGFPuv-vgb9a (图5)从测序文件第27位碱基到第644位碱基截止，这个范围的核 酸序列测序结果与SEQ ID NO. 7序列从第1位碱基开始至第618位碱基相似性达到100%， 这说明各个质粒中的蛋白序列是本专利实施例1中自组织化重组透明颤菌血红蛋白（膜破 坏）的序列。
[0056] pGFPuv-vgb22a(图6)从测序文件第27位碱基到第683位碱基截止，这个范围 的核酸序列测序结果与SEQ ID NO. 8序列从第1位碱基开始至第657位碱基相似性达到 100%，这说明质粒中的蛋白序列是本专利实施例1中自组织化重组透明颤菌血红蛋白（膜 结合）序列。
[0057] pGFPuv-VHb (图4)从测序文件第26位碱基到第601位碱基截止，这个范围的核酸 序列测序结果与SEQ ID NO. 6序列从第1位碱基开始至第576位碱基相似性达到100%，这 说明质粒中的蛋白序列是本专利实施例1中透明颤菌血红蛋白阳性对照序列。
[0058] pGFPuv (图3)从测序文件第101位碱基到第817位碱基截止，这个范围的核酸序 列测序结果与SEQ ID NO. 9序列从第1位碱基开始至第717位碱基相似性达到100%，这说 明质粒中的蛋白序列是本专利实施例1中GFPuv蛋白阴性对照序列。
[0059] 挑取经测序证明目的基因转入宿主细胞，进行发酵研宄。
[0060] 分别将接载有 pGFPuv_vgb9a、pGFPuv_vgb22a、pGFPuv-vgb 以及 pGFPuv 基因的转 化子细胞于有200微克每升氨苄青霉素的LB培养基中，37摄氏度240转每分钟培养，培养 基OD值为0. 7到0. 9时，取30D菌转接到250毫升锥形瓶200毫升LB培养基中，培养基中 含有200微克每升氨苄青霉素，37摄氏度120转每分钟进行培养，培养3天后，利用检测发 酵体系的溶氧值和停止振荡充氧后，细胞培养体系中的溶氧值变化。
[0061] 从图 7 中可以看到从左到右 pGFPuv_vgb9a、pGFPuv_vgb22a、pGFPuv-vgb (阳性对 照样品）以及pGFPuv(阴性对照样品）基因的转化子细胞中GFPuv蛋白已经进行了表达， 紫外光照射下菌体呈现绿色荧光。
[0062] 从蛋白质SDS-PAGE电泳图（图8)上可知，从左向右，条带1是蛋白质标准分子量， 条带 2 ~5 分别为 pGFPuv，pGFPuv_vgb，pGFPuv_vgb9a 和 pGFPuv_vgb22a，各个基因的转化 子细胞中均表达了 GFPuv 蛋白。与 pGFPuv-vgb 相比，pGFPuv_vgb9a 和 pGFPuv_vgb22a 表 达的非质膜结合自组织化重组透明颤菌血红蛋白明显较少。
[0063] pGFPuv-vgMa、pGFPuv_vgb22a、pGFPuv-vgb (阳性对照样品）以及 pGFPuv (阴 性对照样品）基因的转化子细胞在超声裂菌后经12000转每分钟离心30分钟，上清液 的紫外-可见吸收光谱如图9所示，图9中光谱吸收信号从上到下分别为pGFP-vgb， pGFPuv_Vgb9a，pGFPuv_vgb22a和pGFPuv，其中pGFPuv(阴性对照样品）基因的转化子细 胞破碎上清液中呈现395nm吸收的特征信号，该信号来自于GFPuv蛋白；pGFPuv-vgb9a、 pGFPuv-vgb22a、pGFPuv-vgb (阳性对照样品）基因转化子细胞破碎上清液中呈现不同程度 的卟啉蛋白信号（415nm)与GFPuv蛋白信号（395nm)的混合信号，这表明在各个转化子细 胞中透明颤菌血红蛋白/自组织化重组透明颤菌血红蛋白都有所表达，且pGFPuv_vgb9a的 自组织化重组透明颤菌血红蛋白表达量明显大于pGFPuv-vgb22a，也明显大于pGFPuv-vgb 的透明颤菌血红蛋白的表达量。
[0064] 综上所述，以SEQ ID NO. 3为自组织化模块的强质膜结合（膜破坏）自组织化重 组透明血红蛋白具有更高的自组织化重组透明颤菌血红蛋白表达量，在宿主细胞内部也具 有更高的质膜结合形式存在的自组织化透明颤菌血红蛋白。
[0065] 从图10可见，37摄氏度120转每分钟培养3天后，各个转化子细胞在从环境中 获得氧的能力方面呈现出巨大的不同，图10中氧俘获和氧消耗进程曲线从上到下分别为 pGFPuv_vgb22a，pGFPuv_vgb9a，pGFPuv-vgb 和 pGFPuv :
[0066] 1)在维持振荡充氧操作时，pGFPuv_vgb9a、pGFPuv_vgb22a、pGFPuv-vgb (阳性对 照样品）以及pGFPuv(阴性对照样品）基因的转化子细胞所处发酵环境的溶氧值分别为 6. 33mg/L、8. 07mg/L、3. 35mg/L和0· 49mg/L，自组织化重组透明颤菌血红蛋白基因（vgb9a 和vgb22a)的存在极大的提尚了宿主细胞从环境中获得氧的能力；
[0067] 2)在停止振荡充氧操作时，pGFPuv_vgb9a、pGFPuv_vgb22a 和 pGFPuv-vgb 呈现出 优于pGFPuv基因转化子细胞的氧缓释能力，阴性对照样品pGFPuv基因转化子细胞所处环 境在3分钟内溶氧迅速消耗尽，阳性对照样品pGFPuv-vgb基因转化子细胞所处环境在37 分钟后溶氧消耗尽，pGFPuv- Vgb9a、pGFPuv-Vgb22a转化子细胞在37分钟和50分钟消耗尽 环境溶氧，与阳性对照组pGFPuv-vgb相比pGFPuv-vgb9a转化子虽然并未呈现出更长的氧 缓释时间，但是pGFPuv_vgb9a转化子呈现更高的氧储备能力和相对更快的氧利用速度。
[0068] 3)与阳性对照组pGFPuv-vgb转化子相比，pGFPuv_vgb22a转化子同样呈现复杂的 氧缓释曲线，这表征两者具有相似的透明颤菌血红蛋白分布形式。
[0069] 综上所述，自组织化重组透明颤菌血红蛋白可以通过基因工程技术转入目的宿主 细胞中进行表达，自组织化重组透明颤菌血红蛋白在宿主细胞中的表达可以增加宿主细胞 从环境中获得氧的能力，也可以增加宿主细胞在低氧浓度下向环境中释放所储存的氧的能 力。该能力能极大的增强基因工程宿主细胞在溶氧限制的情况下生产基因工程产品的能 力。
[0070] 实施例2
[0071] 为探索自组织化重组透明颤菌血红蛋白的自组织化模块对宿主细胞质膜稳定性 的影响，采用较高的氧供给条件进行实施例1中各转化子细胞的发酵研宄。
[0072] 具体操作如下：
[0073] 分别将接载有 pGFPuv_vgb9a、pGFPuv_vgb22a、pGFPuv-vgb 以及 pGFPuv 基因的转 化子细胞于有200微克每升氨苄青霉素的LB培养基中，37摄氏度240转每分钟培养，培养 基OD值为0. 7到0. 9时，取30D菌转接到250毫升锥形瓶100毫升LB培养基中，培养基中 含有200微克每升氨苄青霉素，37摄氏度180转每分钟进行培养，检测发酵过程中各个转化 子细胞的GFPuv蛋白的表达能力，分别测定培养基中和细胞中的GFPuv荧光信号强度。
[0074] 图11中各个光谱图中实线光谱是宿主细胞在新鲜培养基中检测到的荧光光谱， 虚线是发酵液中样品的荧光光谱，荧光检测条件为激发光波长为395nm，荧光光谱检测范围 为 415nm 到 770nm，狭缝宽度为 Ex = 3nm，Em = 5nm。
[0075] 如图11所示，在发酵进程中pGFPUV-vgb9a转化子细胞随发酵时间延长发酵液中 明显出现GFPuv蛋白509nm处的特异荧光信号，这表明载有SEQ IDNO. 3序列的自