的重量比为1:8 ；
B、解冻上述水蛭素粗品，取290ml加进4倍置冰箱中4°C下预冷的含15%水的冷丙酮中，搅拌后置冰箱中4°C下让其沉淀过夜，次日吸出上清丙酮并离心，在所得沉淀中加入预冷的三氯乙酸28ml使其溶解，离心除去残渣，得唾液腺分泌物浓缩液；
C、用阴离子交换柱层析法对上述唾液腺分泌物浓缩液进行洗脱后，进行凝胶过滤柱层析，即得。
[0026]所述的水蛭充分饥饿的时间为18天，水蛭吸饱诱导物质的时间为50分钟。
[0027]所述的硫酸锌质量分数为0.8%，所述的乙醇质量分数为9%。
[0028]所述的步骤C中阴离子交换柱层析法的具体操作如下:
取适量二乙基氨基纤维素阴离子交换剂加蒸馏水使其膨胀，依次用0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液、0.5mol/L的HCl及0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液各浸泡300分钟后用蒸饱水洗涤至中性；装柱2cm X 60cm至所需高度，用pH=4.6的0.lmol/L梓檬酸钠缓冲液平衡；用5ml的唾液腺分泌物浓缩液或上述三氯乙酸溶液上样进行梯度洗脱并用核酸蛋白检测仪记录绘制出洗脱曲线，分段收集洗脱液，流速为30ml/小时；经检测将有活力部分集中于透析袋中用甘油浓缩，即得。
[0029]所述的步骤C中凝胶过滤柱层析的具体操作如下:
取适量的交联葡聚糖离子交换剂加蒸馏水浸泡4小时，用0.5mol/L NaOH-0.5mol/LNaCl混合液浸泡半小时，抽滤除去硷液并用蒸馏水洗涤至中性，加热煮沸除去气泡；装柱1.5cm X 50cm至所需高度，用pH=7.4的0.lmol/L Tris-HCl-NaCl缓冲液平衡，将上述有活力洗脱液的透析袋甘油浓缩液上样洗脱，分段收集洗脱液，流速为90ml/小时。
[0030]实施例4
本发明的从水蛭唾液中提取水蛭素的方法，包括以下步骤:
A、将水蛭置于容器中充分饥饿，投入诱导物质至水蛭吸饱后，加入催吐剂使其吐出体内的唾液即天然水蛭素粗品液体，然后取出吸血水蛭活体并将其冲洗干净后返回饲养池继续饲养；同时收集容器内的水蛭素粗品液体，置冰箱中冷冻保存待用；
所述的诱导物质由蚯蚓提取液300ml、壳聚糖50g、黄芪多糖20g、葡萄糖粉30g组成；所述的催吐剂为硫酸锌与乙醇的混合液，其比例为1: 2，催吐剂的用量与水蛭活体之间的重量比为1: 10;
B、解冻上述水蛭素粗品，取OOml加进4倍置冰箱中4°C下预冷的含15%水的冷丙酮中，搅拌后置冰箱中4°C下让其沉淀过夜，次日吸出上清丙酮并离心，在所得沉淀中加入预冷的三氯乙酸30ml使其溶解，离心除去残渣，得唾液腺分泌物浓缩液；
C、用阴离子交换柱层析法对上述唾液腺分泌物浓缩液进行洗脱后，进行凝胶过滤柱层析，即得。
[0031 ] 所述的水蛭充分饥饿的时间为20天，水蛭吸饱诱导物质的时间为60分钟。
[0032]所述的硫酸锌质量分数为1%，所述的乙醇质量分数为10%。
[0033]所述的步骤C中阴离子交换柱层析法的具体操作如下:
取适量二乙基氨基纤维素阴离子交换剂加蒸馏水使其膨胀，依次用0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液、0.5mol/L的HCl及0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液各浸泡300分钟后用蒸饱水洗涤至中性；装柱2cm X 60cm至所需高度，用pH=4.6的0.lmol/L梓檬酸钠缓冲液平衡；用5ml的唾液腺分泌物浓缩液或上述三氯乙酸溶液上样进行梯度洗脱并用核酸蛋白检测仪记录绘制出洗脱曲线，分段收集洗脱液，流速为30ml/小时；经检测将有活力部分集中于透析袋中用甘油浓缩，即得。
[0034]所述的步骤C中凝胶过滤柱层析的具体操作如下:
取适量的交联葡聚糖离子交换剂加蒸馏水浸泡4小时，用0.5mol/L NaOH-0.5mol/LNaCl混合液浸泡半小时，抽滤除去硷液并用蒸馏水洗涤至中性，加热煮沸除去气泡；装柱1.5cm X 50cm至所需高度，用pH=7.4的0.lmol/L Tris-HCl-NaCl缓冲液平衡，将上述有活力洗脱液的透析袋甘油浓缩液上样洗脱，分段收集洗脱液，流速为90ml/小时。
[0035]实施例5
从水蛭唾液中提取水蛭素的方法，包括以下步骤:
A、将水蛭置于容器中充分饥饿，投入诱导物质至水蛭吸饱后，加入催吐剂使其吐出体内的唾液即天然水蛭素粗品液体，然后取出吸血水蛭活体并将其冲洗干净后返回饲养池继续饲养；同时收集容器内的水蛭素粗品液体，置冰箱中冷冻保存待用；
所述的诱导物质由蚯蚓提取液200ml、壳聚糖10g、黄芪多糖15g、葡萄糖粉15g组成；所述的催吐剂为硫酸锌与乙醇的混合液，其比例为1: 2，催吐剂的用量与水蛭活体之间的重量比为1:2;
B、解冻上述水蛭素粗品，取250~300ml加进4倍置冰箱中4°C下预冷的含15%水的冷丙酮中，搅拌后置冰箱中4°C下让其沉淀过夜，次日吸出上清丙酮并离心，在所得沉淀中加入预冷的三氯乙酸25ml使其溶解，离心除去残渣，得唾液腺分泌物浓缩液；
C、用阴离子交换柱层析法对上述唾液腺分泌物浓缩液进行洗脱后，进行凝胶过滤柱层析，即得。
[0036]所述的水蛭充分饥饿的时间为15天，水蛭吸饱诱导物质的时间为50分钟。
[0037]所述的硫酸锌质量分数为0.25%，所述的乙醇质量分数为6%。
[0038]所述的步骤C中阴离子交换柱层析法的具体操作如下:
取适量二乙基氨基纤维素阴离子交换剂加蒸馏水使其膨胀，依次用0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液、0.5mol/L的HCl及0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液各浸泡300分钟后用蒸饱水洗涤至中性；装柱2cm X 60cm至所需高度，用pH=4.6的0.lmol/L梓檬酸钠缓冲液平衡；用5ml的唾液腺分泌物浓缩液或上述三氯乙酸溶液上样进行梯度洗脱并用核酸蛋白检测仪记录绘制出洗脱曲线，分段收集洗脱液，流速为30ml/小时；经检测将有活力部分集中于透析袋中用甘油浓缩，即得。
[0039]所述的步骤C中凝胶过滤柱层析的具体操作如下:
取适量的交联葡聚糖离子交换剂加蒸馏水浸泡4小时，用0.5mol/L NaOH-0.5mol/LNaCl混合液浸泡半小时，抽滤除去硷液并用蒸馏水洗涤至中性，加热煮沸除去气泡；装柱1.5cm X 50cm至所需高度，用pH=7.4的0.lmol/L Tris-HCl-NaCl缓冲液平衡，将上述有活力洗脱液的透析袋甘油浓缩液上样洗脱，分段收集洗脱液，流速为90ml/小时。
【主权项】
1.一种从水蛭唾液中提取水蛭素的方法，其特征在于，包括以下步骤: A、将水蛭置于容器中充分饥饿，投入诱导物质至水蛭吸饱后，加入催吐剂使其吐出体内的唾液即天然水蛭素粗品液体，然后取出吸血水蛭活体并将其冲洗干净后返回饲养池继续饲养；同时收集容器内的水蛭素粗品液体，置冰箱中冷冻保存待用； 所述的诱导物质由蚯蚓提取液10?300ml、壳聚糖5?50g、黄芪多糖I?20g、葡萄糖粉1?30g组成； 所述的催吐剂为硫酸锌与乙醇的混合液，其比例为1:1?2，催吐剂的用量与水蛭活体之间的重量比为1:1?10 ; B、解冻上述水蛭素粗品，取250~300ml加进4倍置冰箱中4°C下预冷的含15%水的冷丙酮中，搅拌后置冰箱中4°C下让其沉淀过夜，次日吸出上清丙酮并离心，在所得沉淀中加入预冷的三氯乙酸20-30ml使其溶解，离心除去残渣，得唾液腺分泌物浓缩液； C、用阴离子交换柱层析法对上述唾液腺分泌物浓缩液进行洗脱后，进行凝胶过滤柱层析，即得。2.根据权利要求1所述的从水蛭唾液中提取水蛭素的方法，其特征在于:所述的水蛭充分饥饿的时间为15?20天，水蛭吸饱诱导物质的时间为20?50分钟。3.根据权利要求1所述的从水蛭唾液中提取水蛭素的方法，其特征在于:所述的硫酸锌质量分数为0.05~1%，所述的乙醇质量分数为5~10%。4.根据权利要求1所述的从水蛭唾液中提取水蛭素的方法，其特征在于，所述的步骤C中阴离子交换柱层析法的具体操作如下: 取适量二乙基氨基纤维素阴离子交换剂加蒸馏水使其膨胀，依次用0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液、0.5mol/L的HCl及0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液各浸泡300分钟后用蒸饱水洗涤至中性；装柱2cm X 60cm至所需高度，用pH=4.6的0.lmol/L梓檬酸钠缓冲液平衡；用5ml的唾液腺分泌物浓缩液或上述三氯乙酸溶液上样进行梯度洗脱并用核酸蛋白检测仪记录绘制出洗脱曲线，分段收集洗脱液，流速为30ml/小时；经检测将有活力部分集中于透析袋中用甘油浓缩，即得。5.根据权利要求1所述的从水蛭唾液中提取水蛭素的方法，其特征在于，所述的步骤C中凝胶过滤柱层析的具体操作如下: 取适量的交联葡聚糖离子交换剂加蒸馏水浸泡4小时，用0.5mol/L NaOH-0.5mol/LNaCl混合液浸泡半小时，抽滤除去硷液并用蒸馏水洗涤至中性，加热煮沸除去气泡；装柱.1.5cm X 50cm至所需高度，用pH=7.4的0.lmol/L Tris-HCl-NaCl缓冲液平衡，将上述有活力洗脱液的透析袋甘油浓缩液上样洗脱，分段收集洗脱液，流速为90ml/小时。
【专利摘要】本发明公开一种从水蛭唾液中提取水蛭素的方法，包括以下步骤：A、将水蛭置于容器中充分饥饿，投入诱导物质至水蛭吸饱后，加入催吐剂使其吐出体内的唾液，然后取出吸血水蛭活体返回饲养池继续饲养，同时收集容器内的水蛭素粗品液体；B、解冻上述水蛭素粗品，加进预冷的冷丙酮中，搅拌后置冰箱中沉淀过夜，次日吸出上清丙酮并离心，加入三氯乙酸溶解，离心除去残渣，得浓缩液；C、用阴离子交换柱层析法对上述浓缩液进行洗脱后，进行凝胶过滤柱层析，即得。本发明提供一种具有工艺合理、操作方便实用、水蛭素成品的质量稳定性好和收率较高的特点，且能够避免传统方法对水蛭的一次性掠夺，保护了水蛭的野生资源，又带动了水蛭养殖业的发展。
【IPC分类】C07K14/815, A01K67/033
【公开号】CN104926937
【申请号】CN201510343680
【发明人】谢海林
【申请人】广西复鑫益生物科技有限公司平南分公司
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年6月19日