[0064](7)洗渣
[0065]上一步所得滤渣添加相同质量数的水于85°C下水浴再次浸提lh，然后再用三层纱布进行过滤，保留滤液；所得滤渣再加0.5倍质量数的水于85°C下水浴继续浸提lh，最后再次过滤，弃渣，保留滤液；将步骤6和7的所得所有滤液充分混合。
[0066]⑶分级醇析
[0067]根据多糖醇析分层操作流程图1和图2，分步按比例对步骤6和7两步所得混合滤液进行醇析，具体操作如下:
[0068]①第一步
[0069]所得滤液平均分为若干份，每份150_200ml，分别置于500ml烧杯中，每份按体积比1:1比例加无水乙醇醇析，静置2h后分三层，分别是上层絮状多糖、中间清液以及下层胶状多糖；取上层絮状多糖去除酒精，弃掉中层的中间清液，保留下层胶状多糖；将上层絮状多糖和下层胶状多糖分别在4000rpm条件下离心20min后除去液体，获得上层多糖和下层多糖的固体。
[0070]②第二步
[0071]将上一步所得下层多糖固体用水复溶(每g加水400ml水)，再按体积比1:1向复溶水溶液中添加乙醇进行醇析，静置2h，分层情况与第一步相同；取上层多糖去乙醇，弃中间清液，下层多糖保留。将上层絮状多糖和下层胶状多糖分别在4000rpm条件下离心20min后除去液体，获得上层多糖和下层多糖的固体。
[0072]③第三步
[0073]将第二步所得下层多糖用水复溶(每g加水400ml水)，再按1:1向复溶水溶液中加乙醇醇析，静置2h，分层情况与第一步相同；取上层多糖去乙醇，弃中间清液，下层多糖保留。将上层絮状多糖和下层胶状多糖分别在4000rpm条件下离心20min后除去液体，获得上层多糖和下层多糖的固体。
[0074]④第四步
[0075]将第三步所得下层多糖用水复溶(每g加水400ml水)，再按溶液:乙醇以1:2 (体积比)向复溶水溶液中加乙醇醇析，静置2h，分层情况与第一步相同，取上层多糖去乙醇，弃中间清液，下层多糖保留。将上层絮状多糖和下层胶状多糖分别在4000rpm条件下离心20min后除去液体，获得上层多糖和下层多糖的固体。
[0076]⑤第五步
[0077]将第四步所得下层多糖用水复溶(每g加水400ml水)，再按溶液:乙醇以1:3(体积比)比例向复溶水溶液中加乙醇醇析，静置2h，分层情况同上。取上层多糖去乙醇，弃中间清液，下层多糖保留。将上层絮状多糖和下层胶状多糖分别在4000rpm条件下离心20min后除去液体，获得上层多糖和下层多糖的固体。
[0078]⑥第六步
[0079]将第五步所得下层多糖用水复溶(每g加水400ml水)，再按溶液:乙醇以1:4(体积比)比例向复溶水溶液中加乙醇醇析，静置2h分两层，分层情况是上层絮状多糖和下层清液；取上层多糖去乙醇，弃下层清液。将上层絮状多糖在4000rpm条件下离心20min后除去液体，获得上层多糖的固体。
[0080]以上各步骤样品均标记留样；
[0081]以下为标记原则:E表示经过醇析的样品，下标U、D分别表示多糖醇析液的上、下层多糖，stepX(X= 1.2.3......)表示第X步醇析，其后用连接符连接这一步的醇析比例。例如第三步1:1醇析所得多糖标记为Eustap3 1:1。
[0082](9)冻干
[0083]分级醇析所得全部多糖样品均用冷冻干燥机冷冻干燥24h，得粉状多糖样品。
[0084]实验验证:
[0085](I)复溶
[0086]冷冻干燥所得粉状多糖样品按1:50 (g:ml)比例加蒸馏水复溶，供电泳实验使用。
[0087](12)醋酸纤维薄膜电泳(对分级醇析所得多糖样品)
[0088]将分级醇析所得5种干燥多糖样品
Eustepl 1:1 "> Eustep2 1:1 "> Eustep3 1:1 "> Eustep4 1:2，Εη8?βρ6 1:4
分别按l:50(g:ml)比例加蒸馏水复溶，做醋酸纤维薄膜电泳。电泳条件为140V，15mA，1min。电泳结果见图3-1、图3_2、图3_3、图3_4、图3_5，都呈现单一条带，表明滑菇多糖酒精分级后的5种多糖达到电泳纯。
【主权项】
1.一种滑菇多糖的乙醇醇析分级制备方法，其特征在于，按照以下步骤依进行: a.将滑菇多糖水提取液进行第一次乙醇醇析，将所得水提取液平均分为若干份，每份150-200ml，分别置于500ml烧杯中，每份按体积比1:1比例加无水乙醇醇析，静置2h后分三层，分别是上层絮状多糖、中间清液以及下层胶状多糖；取上层絮状多糖去除酒精，弃掉中层的中间清液，保留下层胶状多糖；将上层絮状多糖和下层胶状多糖分别在4000rpm条件下离心20min后除去液体，获得上层多糖和下层多糖的固体； b.将第一次乙醇醇析后得到的下层多糖继续进行第二次乙醇醇析，依此进行六次乙醇醇析，即每次乙醇醇析分层后所得的下层多糖继续采用乙醇醇析；所述每次分层后所得的下层多糖进行醇析时加入的乙醇与下层多糖溶液的体积比为1:5-1:1 ； c.将上述分级醇析所得全部多糖样品均用冷冻干燥机冷冻干燥24h，得粉状多糖样品。2.根据权利要求1所述的滑菇多糖的乙醇醇析分级制备方法，其特征在于，滑菇多糖水提取液按照以下步骤制备:(I)选剔:选购新鲜滑菇，在购得的新鲜滑菇中挑选无明显组织伤痕、大小均一且干净的优良滑菇备用； (2)称重:将挑选好的优良滑菇置于提前清洗并烘干的500ml烧杯中，用电子天平称取300g供使用； (3)浸泡:在称取好的300g滑菇中加蒸馏水1500ml(滑菇与水的比例为1:5)，室温下浸泡2h,其间每隔20min对浸泡液在速度60rpm下进行搅拌5min ； (4)破碎打浆:将浸泡过的滑菇与水一同倒入高速组织捣碎机中，对滑菇进行破碎打浆l_2min，得滑菇组织浆液； (5)水浴浸提:将上一步所得滑菇组织浆液等分为若干份分别置于500ml烧杯中，每份适量以确保浆液恰好完全浸入水浴锅的热水中，再将盛有滑菇组织浆液的烧杯置于恒温水浴锅中，85 °C下水浴浸提3h; (6)过滤:用三层纱布对水浴过后的滑菇组织浆液进行过滤，所得若干份滤液混合留存，所得滤渣集中在一个烧杯中进行下一步； (7)洗渣:上一步所得滤渣加I倍水于85°C下水浴浸提lh，过滤，保留滤液；所得滤渣再加0.5倍水于85°C下水浴浸提lh，过滤，弃渣，保留滤液；所得所有滤液充分混合。3.根据权利要求1所述的滑菇多糖的乙醇醇析分级制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中的第三次乙醇醇析时加入的乙醇与下层多糖溶液的体积比为1:1 ;第四次乙醇醇析时加入的乙醇与下层多糖溶液的体积比为2:1 ;第五次乙醇醇析时加入的乙醇与下层多糖溶液的体积比为3:1 ;第六次乙醇醇析时加入的乙醇与下层多糖溶液的体积比为5:1。
【专利摘要】本发明公开了一种滑菇多糖的乙醇醇析分级制备。本发明利用水提法经酶处理所得滑菇多糖溶液是多种不同分子量的多糖的混合组分，根据以上乙醇分级沉淀原理，向滑菇多糖的水溶液中逐次加入一定体积分数的乙醇，便可以逐级沉淀出分子量由大到小的多糖，具体是：首次在滑菇水提取液加入1:1(溶液:乙醇＝1:1)，之后每次按如下比例逐次对下层多糖依次加入1:1、1:2、1:3和1:5(溶液:乙醇)的乙醇进行分级醇析多糖。本方法将滑菇多糖通过多步醇析分级制备，简单方便经济，制备过程多糖损失少，而且醇析后的多糖纯度完全能达到各级多糖的功能研究、制作食品饮料和食品营养添加剂等用途的要求。<pb pnum="1" />
【IPC分类】C08B37/00
【公开号】CN105037570
【申请号】CN201510303915
【发明人】李海平
【申请人】天津商业大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年6月5日