结果表明HIF-1A基因荧光信号值符合标准的"S"型曲线。
[0022] 图2为HIF-1A基因转录水平荧光检测结果的熔解曲线。
[0023] 其中，横坐标为温度，纵坐标为单位温度下相对荧光值的变化量，熔解曲线表明该 荧光定量具有高度的检测专一性。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1: 牛HIF-1A基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒： 本试剂盒主要由2 X SYBR GREEN MIX、标准HIF-1A基因模板、引物混合液和超纯水组 成，试剂盒中各成分的组成如表1所示： 表1
试剂盒中各组成成分如下： 2XSYBR Green MIX:Taq DNA 聚合酶 0.1 U/yL、dNTPs 底物 0.4 mmol/L、Mg2+ 5.0 mmol/L、100 mmol/L KC1、20 mmol/L Tris. HC1、0.02 % 明胶、和 SYBR Green 染料。
[0025] 引物混合液：引物A 8 ymol/L、引物B 8 ymol/L，引物1序列为 5' -CAGAATGAAGTGTACCCTAA-3'，引物 2 序列为 5' -TCATCGGTGGITTCTTAT-3'。
[0026] 标准HIF-1A基因模板：浓度为0.8 ymol/L，HIF-lA基因模板序列为5'-CAGAATG AAGTGTACCCTAACTAGCCGGGGGAGAACTATGAACATAAAATCTGCAACATGGAAAGTACTTCACTGCACAGGCCA TATTCATGTATACGATACCAACAGTAACCAATCTCAGTGTGGGTATAAGAAACCACCGATGA-3 ,〇
[0027] 超纯水：纯度超过18. 25MQ ? CM。
[0028] 混合适量的2XSYBR GREEN MIX、标准HIF-1A基因模板/cDNA模板、引物混合液和 超纯水，在热循环仪上进行高温、低温、中温的反复热循环；并在中温时检测和记录荧光值。 该HIF-1A荧光定量PCR由于引物在奶牛、黄牛、牦牛中完全同源，所以能够有效扩增来源于 这些物种的HIF-1A基因，从而检测HIF-1A基因的转录水平。
[0029] 用于检测牛HIF-1A基因转录水平的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤： 1) 按比例配制HIF-1A荧光定量PCR反应液，20 y L反应体系如表2所示。
[0030]表 2
在同一次定量反应中应同时设有阴性对照和阳性对照； 2) 取2父5￥81?61?￡~]\1以1000 1^、引物混合液100 1^、超纯水800 1^充分混匀， 配制1900 y L的FQ-PCR反应预混液； 3) 充分混匀以上各种液体，将预混液成按19 y L/管分装成100小管，加至荧光定量专 用PCR反应管或者反应板中； 4) 配制以10E-1、10E-2、10E-3、10E-4、10E-5系列稀释度的标准HIF-1A基因模板，加上 未稀释的标准HIF-1A基因模板，共6管，每管10 y L ; 5) FQ-PCR扩增每个装有19 yLPCR反应预混液的反应管中分别加入1 yL待测 cDNA、水或标准HIF-1A基因模板，震荡混匀，瞬时离心后上机到荧光定量PCR仪（Bio-Rad CFX96TM)中，95 °C下变性30秒，然后按95 °C 5秒，55. 2°C 20秒热循环40次，并在55. 2 °(：时检测记录荧光信号； 6) PCR反应结束后，读取各个反应的Ct值用以定量分析；同时于3%琼脂糖凝胶行PCR 产物电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统下观察，灰度扫描分析记录各PCR反应的结果。
[0031] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可 以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。 序列表
【主权项】
1. 用于检测牛HIF-IA基因转录水平的引物对，其特征在于，是由引物一和引物二组成 的，所述引物一如序列表中序列1所示，所述引物二如序列表中序列2所示。2. 用于检测牛HIF-IA基因转录水平的试剂盒，其特征在于，包括有以下试剂：2XSYBR GREEN MIX、标准HIF-IA基因模板、权利要求1所述的引物对和超纯水。3. 根据权利要求2所述的用于检测牛HIF-IA基因转录水平的试剂盒，其特征在于，所 述试剂盒中，2X SYBR GREEN MIX、标准HIF-IA基因模板、权利要求1所述的引物对和超纯 水的配比为 5mL :500 y L :500 y L :5mL。4. 根据权利要求3所述的用于检测牛HIF-IA基因转录水平的试剂盒，其特征在于，所 述 2 X SYBR GREEN MIX 由以下试剂组成：Taq DNA 聚合酶 0? IU/ y L、dNTPs 底物 0? 4 mmol/ UMg2+ 5.0 mmol/L、KCl 100 mmol/L、Tris. HCl 20 mmol/L、明胶 0.02%、SYBR Green 染料。5. 根据权利要求4所述的用于检测牛HIF-IA基因转录水平的试剂盒，其特征在于，所 述标准HIF-IA基因模板如序列表中序列3所示，标准HIF-IA基因模板的浓度为0. 8 y mol/ L06. 根据权利要求5所述的用于检测牛HIF-IA基因转录水平的试剂盒，其特征在于，权 利要求1所述的引物对组成的引物混合液中，引物一的浓度为8 ymol/L，引物二的浓度为 8 y mol/L〇7. 根据权利要求6所述的用于检测牛HIF-IA基因转录水平的试剂盒，其特征在于，所 述超纯水的纯度大于18. 25 MQ . cm。8. 用于检测牛HIF-IA基因转录水平的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下 步骤： 1) 配制荧光定量PCR反应预混液：取2 X SYBR GREEN MIX 1000 y L、权利要求1-7任一 所述的引物对组成的引物混合液100 y L、超纯水800 y L充分混匀，配制得到1900 y L的荧 光定量PCR反应预混液； 2) 将步骤1)得到的荧光定量PCR反应预混液按19 y L/管分装成100小管，加至荧光 定量专用PCR反应管或反应板中； 3) 配制10E-1、10E-2、10E-3、10E-4、10E-5系列稀释度的标准HIF-IA基因模板，以及未 稀释的标准HIF-IA基因模板，共6种，每种10 y L，用于检测基因的扩增效率； 4) 荧光定量PCR反应扩增：每个装有19 y L荧光定量PCR反应预混液的反应管或反 应板中分别加入I y L待测cDNA、作为阴性对照的超纯水或作为阳性对照和计算扩增效率 标准的HIF-IA基因模板，震荡混匀，瞬时离心后上机到荧光定量PCR仪中，95 °C下变性30 秒，然后按95 °C 5秒，55. 2 °C 20秒热循环40次，并在55. 2 °C时检测记录荧光信号； 5. PCR反应结束后，读取各个反应的Ct值用以定量分析；同时于3%琼脂糖凝胶进行 PCR产物电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统下观察，灰度扫描分析记录各PCR反应的结果。9. 根据权利要求8所述的用于检测牛HIF-IA基因转录水平的荧光定量PCR检测方法， 其特征在于，所述步骤4)中，装有19 y L荧光定量PCR反应预混液的100个小管中，其中1 管加入作为阴性对照的超纯水、6管加入作为阳性对照和计算扩增效率标准的HIF-IA基因 模板，其余小管加入待测cDNA。
【专利摘要】本发明公开了牛HIF-1A基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒，并提供了具体检测方法，试剂盒包括有以下试剂：2×SYBR？GREEN？MIX、标准HIF-1A基因模板、超纯水和由引物一和引物二组成引物对，引物一如序列表中序列1所示，引物二如序列表中序列2所示。本发明的有益效果为：本发明提供的试剂盒，可以有效检测不同牛种、不同组织、不同时期的HIF-1A基因的mRNA表达状态和表达量，同时可以鉴定该基因与动物低氧适应能力的相关性，以满足生命科学、动物医学和动物科学研究者的检测需要。与现有技术相比，本发明的优点在于：1、本发明实现了方便快捷的检测HIF-1A基因转录水平的目的；2、本发明在检测基因转录水平方面具有灵敏度高、稳定性好、实验成本低的优势。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105039558
【申请号】CN201510489280
【发明人】裴杰, 阎萍, 郭宪, 包鹏甲, 褚敏, 梁春年, 丁学智, 冯瑞林, 王宏博, 朱新书
【申请人】中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年8月11日