点样位置质控分区P1 :1行X8点，杂交 阳性质控分区P2 :1行X4点，杂交阴性质控分区N :1行X4点，猪传染性胸膜肺炎放线杆 菌检测探针分区1 :1行X4点，gij猪嗜血杆菌检测探针分区2 :1行X4点，猪肺炎支原体检 测探针分区3 :1行X4点，猪圆环病毒2型检测探针区分4 :1行X4点，猪繁殖与呼吸综合 征病毒检测探针分区5 :1行X4点，猪瘟病毒检测探针分区6 :1行X4点，猪传染性胃肠 炎病毒探针分区7 :1行X4点，杂交阴性质控分区N :1行X4点，点样位置质控分区P1 :1 行X8点。每张芯片上有至少一个上述微阵列，每个微阵列可以检测一份样品。
[0016] 杂交阴性质控分区N，包含点样缓冲液，点样缓冲液为市售产品，例如博奥生有限 公司生产的。其余各分区包括对应的检测探针和质控探针。
[0017] 图2为本发明的【具体实施方式】，为猪传染性胃肠炎病毒cDNA经PCR扩增产物的杂 交结果。
[0018] 实施例3、试剂准备 1)芯片洗液 根据需要及实际情况，按如下比例配制洗涤液I和洗涤液II。
[0019]洗液I :SSC终浓度为2X，SDS终浓度为0? 2 %。如600 mL洗液I =528 mL蒸馏 水+60mL 20XSSC+12mL 10%SDS，或根据需要按比例配制。
[0020]洗液II:SSC 终浓度为 0? 2X。如 600 mL 洗液II=594 mL 蒸馏水+6 mL 20XSSC， 或根据需要按比例配制。
[0021] 若10% SDS产生白色絮状沉淀，请置于42°C水浴中溶解混匀后配制洗液。
[0022] 2)无水乙醇。
[0023] 3)冰水混合物。
[0024] 实施例4、病毒基因组的提取 按照相应商品化RNA提取试剂盒使用说明书提取患病动物的组织或病毒的细胞增殖 液的全基因组，进行反转录，制备样品cDNA。
[0025] 实施例5、PCR扩增病毒基因组cDNA 1、PCR反应体系：在PCR配液区内，在冰上融化引物Mix及cDNA，按如下体系配制反应 液。25 yLPCR反应液包含rTaq酶12.5 yL、引物Mix: 2.4yL、待测样品DNA5 yL、无 核酸酶灭菌水5. 1 y L ; 其中，所述引物Mix含有： 序列为3￡0 10勵.4的10 11111〇1/1猪传染性胃肠炎病毒上游引物0.2 1^， 序列为SEQ ID N0. 5的10 ymol/L猪传染性胃肠炎病毒下游引物0. 2 y L， 序列为SEQ ID NO. 6的20ymol/L通用引物上游引物lyL， 序列为SEQ ID NO. 7的20ymol/L通用引物下游引物lyL. 猪传染性胃肠炎病毒上游引物SEQ ID NO. 4: 5r -AGGTGACACTATAGAATAAGGTGGTTCTTCTACTACTTAGG-3r ； 猪传染性胃肠炎病毒下游引物SEQ ID NO. 5: 5r -GTACGACTCACTATAGGGAACTGTCATCCTTCTTGTTATTGG-3r ； 通用上游引物 SEQ ID N0.6:5，-cy3-AGGTGACACTATAGAATA-3，； 通用下游引物 SEQ ID NO. 7 :5' -GTACGACTCACTATAGGGA-3'。
[0026] 2、扩增：将配置好的反应液置于PCR扩增仪中，按照表1的PCR反应循环程序进行 PCR反应。
[0027] 表1 PCR反应程序
PCR产物要避光放置。短期保存放置4°C冰箱。
[0028] 实施例6、判读 1、洗片：杂交缓冲液在42°C融化，按下面体系配制杂交液，杂交体系混合液95°C变性8 分钟，冰浴5分钟，备用。配制16 y L杂交液：杂交缓冲液7. 9 y L、PCR扩增产物8 y L、杂 交阳性对照0. 1 y L。
[0029] 打开芯片杂交盒，将杂交盒平放在桌面上，在杂交盒底部凹槽内加入约200 yL灭 菌水。将芯片正面朝上（围栏面朝上，标签朝向操作者）放入杂交盒内两个定位销之间；放 上芯片盖片，注意有凸台的一面朝向芯片，上端先接触芯片，再缓缓盖下；然后用移液器通 过盖片加样孔缓慢注入15 y L变性后的杂交液，杂交液会凭借液体表面张力在盖片下面的 凸台和芯片表面之间形成一道液膜。注意不要震动盖片或芯片以避免破坏液膜。盖紧杂交 盒盖。放入42°C恒温水浴中，静置，杂交2-3小时均可。
[0030] 杂交后，取出芯片放在42°C预热好的洗液I中，42°C震荡清洗5分钟，再用42°C预 热好的洗液II，42°C震荡清洗5分钟（冬季洗液II可清洗两次，每次两分钟)，最后用42°C预 热好的清水清洗一次，清洗后的芯片2000rpm离心2分钟以去除芯片表面的液体，此芯片可 避光保存，在4小时内扫描都有效。
[0031] 2、扫描及结果判读 洗净的芯片使用微阵列芯片扫描仪在晶芯LuxScanTMlOK-A微阵列芯片扫描仪下进行 扫描分析，去除阴性对照背景，与芯片杂交说明对照，判定结果。
[0032] 实施例7、弃物处理 按照当地或国家的传染性与潜在传染性废弃物处理规范来处理使用或未经使用过的 试剂以及污染的废弃物。
【主权项】
1. 用于检测猪传染性胃肠炎病毒的基因芯片，包括：PCR反应混合液、Taq聚合酶、PCR 阳性对照、PCR阴性对照、ddH 20、检测芯片、芯片探针的点样分布、芯片盖片、杂交液、杂交阳 性对照、杂交盒，采用基因芯片微量点样技术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过 化学修饰的基片上，形成的微阵列，其特征在于：所述微阵列包括质控探针区和待测样品探 针区，其中所述质控探针区内设置下述分区： 点样位置质控分区（Pl )，包含至少一个点样位置质控探针：SEQ ID NO. 2; 杂交阳性质控分区（P2)，包含至少一个杂交阳性质控探针：SEQ ID NO. 3; 杂交阴性质控分区（N)，包含点样缓冲液； 所述待测样品探针区内设置至少一个猪传染性胃肠炎病毒探针分区，其中猪传染性胃 肠炎病毒探针DNA序列为SEQ ID NO. 1。2. 根据权利要求1所述用于检测猪传染性胃肠炎病毒的基因芯片，其特征在于：每张 所述检测芯片上包括至少一个权利要求1所述的微阵列，每个微阵列可以检测一份样品。3. 根据权利要求1所述用于检测猪传染性胃肠炎病毒的基因芯片，其特征在于：所述 每条质控探针和猪传染性胃肠炎病毒探针的5'端均通过15个胸腺嘧啶核苷酸连接有一 个氨基。4. 利用权利要求1所述基因芯片检测猪传染性胃肠炎病毒的非疾病检测目的的检测 方法，包括如下步骤： (1) 待测样品制备：按照商品化RNA提取试剂盒使用说明书提取待测样品全基因组 RNA，进行反转录，制备待测样品cDNA ; (2) PCR扩增：25 y L PCR反应液包含：rTaq酶12.5 yL、引物Mix: 2.4 yL、待测 样品cDNA 5 y L、无核酸酶灭菌水5. I y L ; 其中，所述引物Mix含有： 序列为SEQ ID NO. 4的IOy mol/L猪传染性胃肠炎病毒上游引物0.2 yL， 序列为SEQ ID NO. 5的10 ymol/L猪传染性胃肠炎病毒下游引物0. 2 yL， 序列为SEQ ID NO. 6的20 ymol/L通用引物上游引物Iy L， 序列为SEQ ID NO. 7的20 ymol/L通用引物下游引物IyL. 按如下步骤进行扩增：94°C 5 min;94°C 30 sec，56°C 30 sec，72°C 25 sec 循环 12 次；94°C 30 sec，5(TC 30 sec，72°C 25 sec 循环 30 次；72°C 5min; (3) 杂交：首先配制杂交缓冲液：杂交缓冲液7. 9 y L、PCR扩增产物8 y L、杂交阳性对 照0.1 y L，混匀后95°C变性8min，冰上放置5min，然后采用15 y L杂交液进行杂交； (4) 结果判读：用微阵列芯片扫描仪扫描分析，去除阴性对照背景，与芯片杂交说明对 照，判定结果。5. 根据权利要求4所述检测方法，其特征在于：所述杂交缓冲液每1000 y L包括 20 X SSC 500 yL、10% SDS IOy L 及 DEPC H2O 490 yL。
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测猪传染性胃肠炎病毒的基因芯片及其检测方法。提供了探针和PCR引物，通过标准毒株基因组序列分析设计PCR引物，对目的基因克隆及测序分析，然后设计特异性探针，可对猪传染性胃肠炎病毒进行鉴定。本发明旨在建立一种灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果的检测猪传染性胃肠炎病毒的芯片方法。
【IPC分类】C40B40/06, C12Q1/68, C12Q1/70
【公开号】CN105040110
【申请号】CN201510479683
【发明人】王昱, 杨俊 , 聂福平, 李应国, 保雨, 李贤良, 王国民, 张超, 艾军
【申请人】重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年8月7日