用于检测猪传染性胃肠炎病毒的基因芯片及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物芯片领域。具体而言，本发明涉及一种猪传染性胃肠炎病毒的芯 片检测装置。
【背景技术】
[0002] 猪传染性胃肠炎（porcine transmissible gastroenteritis, TGE)是由猪传染 性胃肠炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV)引起的以猪呕吐、 腹泻、脱水为特征的高度接触性传染病，对养猪业造成巨大的损失。该病可感染不同年龄的 猪，但对新生仔猪的致死率高达100%，成年猪感染后发病温和，可能会出现生长障碍和无乳 等现象。近年来，该病在世界各地频频发生，我国四川、湖北、吉林、陕西、台湾、北京、广州等 多个地区也均有流行，并且呈上升趋势。由于TGEV经常与其他病毒混合感染，或常伴细菌 的继发感染，使临床症状复杂多样，混合感染和继发感染大大增加了 TGEV诊断的难度。
[0003] 猪传染性胃肠炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV) 属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属的不分节段的单股正链RNA病毒。TGEV基因组 由7个开放阅读框（0RF1-0RF7)组成，5'端有甲基化的帽子结构，3'端有PloyA尾，使得 病毒RNA具有感染性。TGEV不仅能引起急性肠炎，而且常为持续感染，即在感染100d后，在 康复猪的呼吸道中仍能检测到病毒的存在，严重影响了养猪业的持续健康发展。猪对TGEV 最为易感，而猪以外的动物猫、狗、狐狸等不致病，但可带毒、排毒。大量的带毒动物促进了 猪传染性胃肠炎的爆发。因此，建立一种快速、准确检测该病毒的方法，有利于保障我国养 猪业的发展。在对其它动物或者肉制品的出入境快速检测中也有重要作用。
[0004] 基因芯片（Gene chip)是由DNA或寡核苷酸探针密集排列在经过共价结合醛基、 氨基或多聚赖氨酸的固相支持物所形成的探针阵列，在适当的温度、湿度条件下，利用特异 性探针与经过适当方式标记的待检样品DNA通过碱基互补配对杂交，然后通过相应的检测 设备，检测杂交信号的位置和强弱，判断样品种类，完成疾病检测和基础研究等方面的工 作。该方法具有高通量、平行化、微量化、自动化、低成本的优点。因此，该技术被广泛应用 于诊断检测、差异表达分析、测序等诸多领域。目前，基因芯片检测技术已应用于多种疾病 的检测，但缺乏猪传染性胃肠炎病毒基因芯片的检测方法。综合寡聚核苷酸芯片的优点，本 发明建立一种快速、准确鉴定猪传染性胃肠炎病毒的基因芯片检测技术，为控制猪传染性 胃肠炎病毒的传播及进出境动物的检疫具有重要作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是建立一种灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果的检 测猪传染性胃肠炎病毒的基因芯片。
[0006] 为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：用于检测猪传染性胃肠炎病毒的基 因芯片，包括：PCR反应混合液、Taq聚合酶、PCR阳性对照、PCR阴性对照、ddH 20、检测芯片、 芯片探针的点样分布、芯片盖片、杂交液、杂交阳性对照、杂交盒，采用基因芯片微量点样技 术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的基片上，形成的微阵列，其特征 在于：所述微阵列包括质控探针区和待测样品探针区，其中所述质控探针区内设置下述分 区： 点样位置质控分区（P1)，包含至少一个点样位置质控探针：SEQ ID NO. 2; 杂交阳性质控分区（P2)，包含至少一个杂交阳性质控探针：SEQ ID NO. 3; 杂交阴性质控分区（N)，包含点样缓冲液； 所述待测样品探针区内设置至少一个猪传染性胃肠炎病毒探针分区，其中猪传染性胃 肠炎病毒探针DNA序列为SEQ ID NO. 1。
[0007] 利用上述基因芯片检测猪传染性胃肠炎病毒的检测方法，包括如下步骤： (1) 待测样品制备：按照商品化RNA提取试剂盒使用说明书提取患病动物的组织或病 毒的细胞增殖液的全基因组RNA，进彳丁反转录，制备待测样品cDNA ; (2) PCR扩增：25 yLPCR反应液包含rTaq酶12.5 yL、引物Mix: 2.4yL、待测样品 DNA 5 y L、无核酸酶灭菌水5. 1 y L ; 其中，所引物Mix含有： 序列为3￡0 10勵.4的10 11111〇1/1猪传染性胃肠炎病毒上游引物0.2 1^， 序列为SEQ ID N0. 5的10 ymol/L猪传染性胃肠炎病毒下游引物0. 2 y L， 序列为SEQ ID NO. 6的20ymol/L通用引物上游引物lyL， 序列为SEQ ID NO. 7的20ymol/L通用引物下游引物lyL. 按如下步骤进行扩增：94°C 5 min;94°C 30 sec，56°C 30 sec，72°C 25 sec 循环 12 次；94°C 30 sec，5(TC 30 sec，72°C 25 sec 循环 30 次；72°C 5min; (3) 杂交：首先配制杂交缓冲液：杂交缓冲液7. 9 y L、PCR扩增产物8 y L、杂交阳性对 照0. 1 y L，混匀后95°C变性8min，冰上放置5min，然后取15 y L杂交液进行杂交； (4) 结果判读：用微阵列芯片扫描仪扫描分析，去除阴性对照背景，与芯片杂交说明对 照，判定结果。
[0008] 本发明具有如下优点： (1)成功地构建了 TGEV检测基因芯片：本发明所制备的基因芯片采用的各条筛选探针 可与对应病原体目的基因进行特异性结合，杂交信号较强且稳定。
[0009] (2)制备的检测基因芯片具有良好的方法学特征。本发明建立了一种特异性好、灵 敏度高、稳定性强和节时省力的基因芯片检测方法。
[0010] (3)检测基因芯片的构建，为混合感染疾病的同步检测和鉴别诊断提供快速、高效 的手段，为今后出入境动物检疫、出入境食品安全和相应疫病控制提供了技术保障。对满足 进出境动物检疫工作的需要，控制猪传染性胃肠炎病毒的传播，保障我国的畜牧业安全、健 康发展具有十分重要的意义。
【附图说明】
[0011 ] 图1为芯片探针分布不意图； 图2为猪传染性胃肠炎病毒核酸杂交结果； 图中：P1-点样位置质控分区；P2-杂交阳性质控分区；N-杂交阴性质控分区；1-猪传 染性胸膜肺炎放线杆菌探针分区；2-副猪嗜血杆菌探针分区；3-猪肺炎支原体探针分区； 4-猪圆环病毒2型探针分区；5-猪繁殖与呼吸综合征病毒探针分区；6-猪瘟病毒探针分 区；7-猪传染性胃肠炎病毒探针分区； 杂交说明：P1 :探针固定阳性对照，监控芯片点样过程，芯片杂交前后都应阳性； P2 :杂交阳性对照，监控芯片杂交过程，检测任何样品都应阳性； N :杂交阴性对照，检测任何样品都应阴性； 猪传染性胃肠炎病毒cDNA经PCR扩增产物的杂交结果：除质控探针符合要求外，7号 探针壳。
【具体实施方式】
[0012] 下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于 实施例。
[0013] 实施例1，本发明是分别对猪传染性胃肠炎病毒细胞增殖，提取病毒基因组RNA， 并进行反转录。对猪传染性胃肠炎病毒的特异保守序列进行克隆、测序分析，根据测序结果 设计了 1条寡核苷酸探针，可与相应病原体的PCR产物进行特异性结合，PCR进行基因组扩 增时，上游通用引物5 '端利用Cy3荧光色素进行标记，探针可与此产物在42°C下进行杂 交。根据荧光信号位置、强度判断杂交结果，以此来检测猪传染性胃肠炎病毒。根据Genbank 网站上公布的猪传染性胃肠炎病毒的全基因序列利用Primer Premier 5.0生物软件设计 PCR引物SEQ ID N0. 4和SEQ ID N0. 5。同时，克隆基因序列，并进行测序、比对分析，利用 fastPCR生物软件设计1条特异性寡核苷酸探针SEQ ID NO. 1。通过这4条PCR引物和1 条特异性的探针，可以特异的、敏感的快速检测株传染性胃肠炎病毒。根据国家质量监督检 验检疫总局文件（2009. 178号）《关于进一步加强进出境猪甲型H1N1流感检验检疫工作的 通知一一A型流感分型基因芯片检测方法》提供的质控序列合成本发明用质控序列SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3。
[0014] 每条探针的5'端均通过15个胸腺嘧啶核苷酸连接有一个氨基，具体核苷酸序列 如下： SEQ ID NO. 1 为： 5' -nh2-t15- GCACCATCCTTGGCAACCCAGACAACTCCATCTAATT ； SEQ ID NO. 2 为： 5, -nh2-t15-gctgcctcggcaaggagt-tamra; SEQ ID NO. 3 为： 5' -NH2-T15- GTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTo
[0015] 实施例2,参见图1，用于猪传染性胃肠炎病毒检测的基因芯片，采用基因芯片微 量点样技术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的基片上，形成8行X 7 列的微阵列。微阵列上探针分布从上到下依次为：