一种海湾扇贝多肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药领域，具体讲，涉及一种海湾扇贝多肽及其应用。
【背景技术】
[0002] 海洋肽类因其具有抗肿瘤、抗氧化、抗真菌、抗病毒及免疫调节等生理活性，成为 目前海洋性功能成分的研究热点之一。海湾扇贝（argopectenirradias)属瓣鲍纲，异柱 目，扇贝科，扇贝属，粗蛋白含量为12%左右，氨基酸组成均衡，因此海湾扇贝是海洋肽类开 发利用的理想原料之一，但国内外有关海湾扇贝多肽提取工艺的研究尚无报道。
[0003] 研究表明，海洋多肽的生理作用与组成多肽的氨基酸序列有关；一些生物活性肽 的生理功能还与多肽的结构、疏水性、所带电荷等有关。
[0004] 恶性肿瘤又称为癌症，是目前严重威胁人类生命和影响人类健康的主要疾病之 一。海洋生物来源的抗肿瘤活性物质具有毒副作用小、药效高的特点，现已成为天然抗癌药 物极好的潜在资源。扇贝是海洋生物的一种，因其营养价值高且含有多种生理活性成分，在 海洋抗癌药物研究中具有很好的应用和开发前景。
[0005] 关于海洋多肽的研究，已公开一些相关的现有技术。
[0006] 专利申请200810189188. 3公开了文蛤活性多肽在制备抗肺癌药物中的应用，该 申请采用盐析醇沉的方法制备得到文蛤活性多肽，采用MTT法和细胞计数法，实验结果显 示，文蛤多肽对肺癌细胞A549具有特异的诱导杀死效应，对肺癌细胞A549有明显的抑制作 用。
[0007] 专利ZL201110036545. 4公开了一种文蛤多肽及其制备方法，该文蛤多肽N-末端 序列为IDEIQNTGGGTNFR，其分子量为15Ku，其制备方法为将文蛤体液经过硫酸铵分级沉 淀、超滤、离子交换层析、疏水层析、反相层析后获得一种分子量为15Ku的多肽。用MTT比 色法检测其抗肿瘤活性，发现该化合物能显著抑制多种肿瘤细胞的生长，但对正常细胞没 有抑制作用。
[0008]目前，有关扇贝多肽结构及生理功能的研究多见于栉孔扇贝多肽，而海湾扇贝多 肽（polypeptidefromargopectenirradias，PAI)的相关研究尚属空白。为次，特提出本 发明。
【发明内容】
[0009] 本发明的首要发明目的在于提出了一种海湾扇贝多肽。
[0010] 本发明的第二发明目的在于提出该海湾扇贝多肽的用途。
[0011] 为了实现本发明的目的，采用的技术方案为：
[0012]本发明涉及一种海湾扇贝多肽，其制备方法包括：对新鲜海湾扇贝进行前处理、研 磨、超声破碎、酶解、超滤和层析；其中，酶解的步骤为：先用复合蛋白酶处理，再用碱性蛋 白酶处理；复合蛋白酶处理的条件为：底物浓度为12%~14%、酶用量1200~1400U/g、 pH5. 5~7. 0、温度50~55°C、时间1~3h;其中，pH优选为6. 5~7. 0、温度优选为50~ 54°C;碱性蛋白酶处理的条件为：底物浓度6 %~8 %、酶用量600~700U/g、pH6.O~8.O、 温度56~60°C、时间2~3h;其中，pH优选为7. 0~8. 0。
[0013] 本发明的海湾扇贝多肽的分子量为700~950u，优选700~790u。
[0014] 本发明的第一优选技术方案为：超声破碎的条件为：温度50~55°C，功率350w， 超声和间歇时间比3 : 1、时间20~30min。
[0015] 本发明的第二优选技术方案为：在复合蛋白酶处理后，经过低温三级超滤后再碱 性蛋白酶处理，低温超滤的温度为5~10°C，截留分子量为0~Iku的蛋白水解物。
[0016] 本发明的第三优选技术方案为：超滤步骤的条件为：将经过两步水解后的海湾扇 贝水解液依次进行三级超滤，截留分子量为〇~Iku的蛋白水解物。
[0017] 本发明的第四优选技术方案为：三级超滤的超滤膜为分别经过截留分子量为 10ku、5ku和Iku的超滤膜。
[0018] 本发明的第五优选技术方案为：层析步骤的条件为：采用SpehadexG-15层析柱 对分子量为0~Iku的组分进行分离纯化，具体步骤：上样浓度为20~30mg/mL，上样量 1~4mL，蒸馏水洗脱流速0. 1~0. 15mL/min。
[0019] 本发明的第六优选技术方案为：在水解后还包括一个加热灭酶的步骤，条件为： 加热至95~KKTC灭酶15~20min。
[0020] 本发明还涉及该海湾扇贝多肽在制备预防或治疗癌症药物中的应用，以及海湾扇 贝多肽在制备预防癌症的食品或保健品中的应用，癌症优选肝癌。
[0021] 本发明的复合蛋白酶选用丹麦诺维信（Novo)公司生产的复合蛋白酶 Protemax(规格2. 4AU/g);碱性蛋白酶选用丹麦诺维信（Novo)公司生产的碱性内切蛋白酶 Alcalase(规格I. 5AU/g)。
[0022] 下面对本发明的技术方案做进一步的解释和说明。
[0023] 本发明以海湾扇贝为原料，对海湾扇贝多肽的制备工艺进行优化，提出了一种产 量高、活性高的海湾扇贝多肽制备方法。此外对其抗肿瘤效果进行了研究，研究发现，本发 明的海湾扇贝多肽具有较强的抑制肝癌细胞生长的作用。
[0024] 本发明通过对扇贝多肽的深入研究，提出了一种高活性的海湾扇贝多肽，该多肽 具有较小的分子量，经人肝癌SMMC-7721细胞的抑制率试验，表明其具有很强的抑制肿瘤 细胞的活性。本发明创新性的使用碱性蛋白酶对扇贝进行水解，克服了酸性水解酶酶切位 点不确定的缺陷。为了使扇贝中蛋白质充分水解，本发明使用了两种蛋白酶分别水解，不仅 避免了两种水解酶共同作用对蛋白质大分子的共同剪切作用从而造成游离氨基酸含量增 加的缺陷，并且最大限度的对蛋白质大分子片段进行了水解，提高了目的多肽的产量，水解 率可达到48. 10%。
[0025] 本发明中水解率的计算方式为：
[0026] DH(% )=(氨基酸态氮的质量/样品中总氮的质量）X100%
[0027] ①总氮含量：样品中总氮含量的测定采用凯氏定氮法。
[0028] ②氨基酸态氮含量：采用甲醛电位滴定法进行滴定，按如下公式计算。
[0030] X-氨基酸态氮含量，g/100mL;
[0031]C-NaOH标准溶液的浓度，mol/L;
[0032]V1-测定试样稀释液加入甲醛后消耗NaOH标准溶液的体积，mL;
[0033]V2-空白滴定加入甲醛后消耗NaOH标准溶液的体积，mL;
[0034]V3-试样稀释液取用量，mL;
[0035] 0? 014-与I.OOmLNaOH标准滴定溶液相当的氮的质量，g。
[0036] 本发明涉及一种海湾扇贝多肽的制备方法包括：对新鲜海湾扇贝进行前处理、研 磨、超声破碎、酶解、超滤和层析。
[0037] 本发明选用了在研磨后进行超声破碎的步骤，节约水解的时间，避免游离氨基酸 含量增高，可提高水解效率。
[0038] 本发明创新的采用了两步酶解的方法对海湾扇贝进行水解，先用复合蛋白酶处 理，再用碱性蛋白酶处理。并对复合蛋白酶和碱性蛋白酶的酶解处理条件进行了优化选择。 在选用复合蛋白酶处理中，选择了高底物浓度、高酶用量的处理方式；在采用碱性蛋白酶处 理过程中，选用了低底物浓度和低酶用量的处理条件，并分别对pH值和处理温度进行了优 化。单酶法水解存在酶水解度较低、耗时长及多肽得率低等缺点；而将几种酶结合起来使用 则可以提高酶解效率。因此，从水解度和多肽得率等方面综合考虑，本发明选用水解度较高 的复合蛋白酶和碱性蛋白酶进行分步水解，以求得到水解度高，低分子量的海湾扇贝多肽。 经试验发现，本发明采用不同的酶接力水解，所达到的水解度及多肽得率均高于加入单种 水解酶水解、以及一次性加入混合酶水解。
[0039] 通过对蛋白水解产物的进一步纯化，得到了分子量为700~790u的多肽产物，经 人肝癌SMMC-7721细胞的生长抑制试验，证明其具有更强的抑制肿瘤细胞的活性。
[0040] 在对蛋白水解物的纯化过程中，先对经过两步水解的产物进行三级超滤，分别经 过截留分子量为l〇ku、5ku和Iku的超滤膜，获得不同分子质量的滤液组分：>IOku组分、 5ku~IOku组分、Iku~5ku组分、0~Iku组分。然后对含有本发明活性多肽的0~Iku 组分进行层析，以获得特定分子量大小的目的多肽。层析采用SpehadexG-15层析柱，该柱 依据分子筛效应分离原理，具有稳定性好，分离度高等优点。经层析处理后，目的多肽的纯 度可以达到83%。
[0041] 在本发明的某一优选实施方式中，在复合蛋白酶处理后，可以先经过低温超滤，再 进行碱性蛋白酶处理，低温超滤的温度为5~KTC，先把分子量为0~Iku的多肽截留出 来，避免在后续的酶处理过程中的过度分解。
[0042] 以往对活性物质进行体外抑瘤活性检测的报道中，多采用四甲基偶氮唑蓝比色法 (MTT法），与MTT相比，WST-8具有操作简化、结果更加稳定、线性范围更宽、灵敏度更高的 优点。为此，本发明选用CCK-8法检测海湾扇贝多肽对人肝癌SMMC-7721细胞的增殖抑制 作用，结果表明，不同浓度（4mg/mL、8mg/mL和12mg/mL)的海湾扇贝多肽在24h能显著抑制 SMMC-7721细胞的增殖，随着海湾扇贝多肽浓度的提高，抑制效果逐渐增强，12mg/mL海湾 扇贝多肽组的效果最明显。说明，本发明的海湾扇贝多肽能够抑制体外培养的SMMC-7721 细胞增殖，具有抗肿瘤活性。
[0043] 在细胞凋亡研究中流式细胞术能够较准确地测出凋亡细胞占所测总细胞的百分 含量。本发明用AnnexinV-PE/7-AAD双染细胞凋亡试剂盒经流式细胞仪检测SMMC-7721 细胞的凋亡情况，结果显示，与对照组相比，不同浓度海湾扇贝多肽处理组的SMMC-7721细 胞均出现一定程度的凋亡，且随