猕猴桃AdADH2基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及猕猴桃AdADH2基因与应用。
【背景技术】
[0002] 猕猴桃属于猕猴桃科（Actinidiaceae)猕猴桃属（Actinidia)落叶性藤本果树， 全世界猕猴桃属植物有54个种21个变种，共约75个分类单位，种质资源极其丰富。1904 年，新西兰从我国引种猕猴桃，人工驯化，开始品种选育工作和商业化生产。目前市场上栽 培的主要品种大多选自于美味猕猴桃和中华猕猴桃，还有少量选自软枣猕猴桃。猕猴桃由 于含有极其丰富的营养价值，尤其是Vc含量很高，被誉为"Vc之王"，所以越来越受到人们 的青睐。
[0003] 江苏省夏季雨季较长，雨水较多，给猕猴桃生长生产带来了严峻的挑战。2011年， 由于雨季雨水较多，涝害严重，扬州市大量成年猕猴桃植株死亡，给果农造成了巨大的经济 损失。因此，猕猴桃的耐涝问题是制约江苏省猕猴桃产业发展的主要因素之一。选育耐涝 性砧木和品种资源无疑是解决该问题的主要途径。随着分子生物学及基因工程技术在果树 领域的应用，应用基因工程技术手段来改造猕猴桃的抗性，是今后抗性研究的目标。因此， 挖掘和研究猕猴桃耐涝基因将会为通过基因工程技术手段培育猕猴桃耐涝性砧木和品种 资源奠定理论基础。
[0004]目前，有关植物耐涝基因筛选方面的研究较少，关于耐涝基因的表达与调控方面 的研究更是微乎其微。猕猴桃品种'金魁'是我国选育的美味猕猴桃品种之一，抗旱、耐涝、 抗冻能力较强。在猕猴桃耐涝基因挖掘方面的研究还未见报道。因此克隆和研究猕猴桃抗 逆相关基因，对于开发具有中国自主知识产权的果树抗逆基因具有重要的意义。
【发明内容】
[0005] 发明目的：
[0006] 本发明的目的是提供猕猴桃AdADH2。
[0007] 本发明的另一目的是提供该猕猴桃AdADH2的编码基因。
[0008] 本发明的又一目的是提供该基因的功能。
[0009] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0010] 本发明所提供的猕猴桃AdADH2,来源于猕猴桃优良品种'金魁'，氨基酸序列如SEQ IDN0. 2 所示。
[0011] 本发明所述的猕猴桃AdADH2的编码基因，其cDNA序列如SEQIDNO. 1所示，含有 1143bp的最大开放阅读框，编码SEQIDNO. 2所示的380个氨基酸残基序列。
[0012] 含有本发明AdADH2基因的表达载体。
[0013] 所述的表达载体优选将所述的猕猴桃AdADH2的编码基因插入到pCAMBIA1301载 体的KpnI和SacI酶切位点间所得。
[0014] 宿主菌是指将含有本发明AdADH2基因的表达载体转入的根癌农杆菌EHA105.
[0015] 扩增AdADH2cDNA全长的引物为：
[0016] AdADH2-0RFsense:5'-CATAGAGTTCTGTTTTCAGTGAAG-3'
[0017]AdADH2-0RFantisense:5'-TGAAAAGTATTGTAGGCAGATTAC-3'
[0018] 实时荧光定量RT-PCR分析中涉及的AdADH2的qPCR引物为：
[0019] AdADH2-qPCRsense:5,-CTGAAATGACCAGCGGAGGAG-3'
[0020] AdADH2-qPCRantisense:5'-TGTCTTGAATACGGCATCTTTGTG-3'
[0021] 上述猕猴桃AdADH2、其编码基因、含有编码基因的表达载体、宿主菌在培育耐涝或 耐盐植物中的应用。
[0022] 有益效果：
[0023] 本发明在金魁猕猴桃中克隆到一个AdADH2基因，AdADH2参与猕猴桃耐涝和耐盐 胁迫过程。
[0024]AdADH2编码基因在涝害胁迫、低温胁迫、和盐害胁迫诱导条件下表达。转基因拟南 芥中过量表达AdADH2编码基因，与对照组相比，转基因材料表现耐涝、耐盐的特性。这一结 果说明AdADH2基因参与植物抵抗涝害或盐害胁迫过程中起着非常重要的作用。
[0025] 本发明的AdADH2对于培育耐涝或耐盐植物品种或植物改良品种具有重要意义， 在作物育种方面具有广泛的应用前景。
[0026] 利用本发明的植物表达载体，将AdADH2基因导入植物体内，可以获得耐涝和耐盐 的转基因植株。
【附图说明】
[0027] 图1AdADH2基因在猕猴桃涝害（A)、低温⑶和高盐（C)胁迫下的表达特性
[0028] 图2转基因拟南芥与野生型拟南芥在涝害胁迫处理条件下的表型观察
[0029]ADH2-3 :转基因拟南芥株系；WT:野生型株系；A:处理前表型；B:涝害处理2周后 表型；C:恢复生长1周后表型。
[0030] 图3转基因拟南芥与野生型拟南芥在涝害胁迫处理后恢复生长1周后的根长（A)、 鲜重（B)和干重（C)的统计分析
[0031]ADH2-3 :转基因拟南芥株系；WT:野生型株系；
[0032]图4转基因拟南芥与野生型拟南芥在盐胁迫处理条件下的发芽情况分析
[0033]ADH2-3 :转基因拟南芥株系；WT:野生型株系；
[0034] 图5转基因拟南芥与野生型拟南芥在盐胁迫处理条件下的发芽率统计分析
[0035]ADH2-3 :转基因拟南芥株系；WT:野生型株系；
【具体实施方式】
[0036] 下列实例中所有的方法无特别说明，均为常规方法
[0037] 实施例1猕猴桃AdADH2基因的克隆与鉴定
[0038] 实验材料为猕猴桃品种'金魁'扦插苗，对其进行涝害处理0天，1天，2天，4天 后，取其根部组织，参考蔡斌华等改进的CTAB法（蔡斌华，张计育，高志红，渠慎春，佟兆国， 靡林，乔玉山，章镇.一种改良的提取草莓属叶片总RNA的方法[J].江苏农业学报，2008， 24(6) :875-877)提取RNA，反转录cDNA。根据已经报道物种的序列，在ADH2最大开放阅 读框两端分别设计引物AdADH2-0RFsense:5' -CATAGAGITCTGTITTCAGTGAAG-3'（SEQID N0.3)和AdADH2-0RFantisense:5'-TGAAAAGTAITGTAGGCAGATTAC-3'（SEQIDN0.4)。以 cDNA为模板，进行PCR，反应条件为：94°C5min热变性；94°C45s，58°C45s，72°C90s，共 35 个循环；72°C延伸15min。将PCR产物用胶回收试剂盒（Genscript)回收后，与pMD19-T载 体（Takara,Japan)连接，然后转化大肠菌DH5a，挑选阳性克隆，进行测序。测序得到的片 段长度为1221bp(SEQIDNO. 5)，含有1143bp的最大开放阅读框（SEQIDNO. 1)，编码380 个氨基酸残基序列（SEQIDNO. 2)。
[0039] 实施例2猕猴桃AdADH2基因在涝害、低温和高盐胁迫条件下的表达特性
[0040] 以猕猴桃品种'金魁'为材料，对其进行涝害、低温（4°C)、高盐（200mMNaCl) 处理，处理后取其叶片，提取RNA，cDNA的合成用能消除