Ph450酶的大量制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白质提取技术领域，具体涉及一种PH450酶的大量制备方法。
【背景技术】
[0002] PH450色素代谢酶系，或者又称CYPH450酶、P450酶，是一类主要存在于肝脏、肠 道中的单加氧酶，多位于细胞内质网上，催化多种内、外源物质的(包括大多数临床药物）代 谢，因为分光光度法测得的吸收峰在450nm附近，故名。其主要分布在SER(内质网膜）中， 但也存在于质膜、线粒体、高尔基体、过氧化物酶体、核膜等细胞器的膜中，具有解毒作用， 通常可将脂溶性有毒物质，代谢为水溶性物质，使有毒物质排出体外。由于其作为一种末端 加氧酶，参与了生物体内的解毒、留醇类激素合成等过程，还是药物代谢过程中的关键酶， 而且对细胞因子和体温调节都有重要影响；并且，其色素代谢功能可以迅速溶解和代谢皮 肤各层次各种色数及毒素，打通皮肤排毒通道；所以在药物辅助吸收和面部色素清除等产 品中均有广泛的应用。
[0003]目前，由于本身PH450酶发现是大量存在于人的肝脏中，虽然后续也发现了细菌、 真菌及动植物中有其存在，比较难以自然地通过除杂并分离大量制备得到；为了满足大量 应用的要求，大量进行PH450酶制备的过程一般是通过构建PH450酶基因工程菌的方式在 体外进行大量表达获得。但是这一方式进行制备的过程中，由于表达的基因工程菌是根据 基因序列表达获得PH450酶蛋白产物，由于不存在体内代谢过程中的表达后的功能修饰步 骤，所以这一种方式制备得到的PH450酶的活性和品质大大降低，远无法达到高品质应用 的要求。
【发明内容】
[0004] 本发明实施的目的在于克服现有的缺陷，提供一种从蓝藻中进行具有完整生物活 性PH450酶的大量制备方法。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下： 一种PH450酶的大量制备方法，包括如下步骤： 获取蓝藻并进行大量培养，并在培养过程中用PH450酶诱导剂进行诱导； 在所述大量培养结束后收集蓝藻细胞，提取蓝藻细胞总蛋白； 用人PH450酶作为抗原进行免疫反应，制备多克隆抗体； 以所述多克隆抗体作为亲和介质制备亲和层析柱； 将所述提取的蓝藻细胞总蛋白于所述亲和层析柱进行过柱。
[0006] 本发明上述PH450酶的大量制备方法，基于蓝藻和人PH450酶在蛋白质的三维结 构、活性功能几乎完全相同，且蓝藻代谢简单、易于诱导和分离的情形，将蓝藻诱导培养产 物用PH450酶的特异性抗体进行亲和层析；相比现有的基因工程菌发酵制备的方法，本发 明大量制备的PH450酶是蓝藻细胞代谢产生的在经过细胞内功能修饰的活性酶，品质比较 好；而且纯化分离过程简单，方法的效益更高。
【附图说明】
[0007] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中： 图1为人类CYP2C9与细菌CYPH450BM3晶体结构的重叠图； 图2为本发明实施例以蓝藻培养物进行层析之后洗脱组分进行SDS-PAGE电泳银染的 示意图。
【具体实施方式】
[0008] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0009] 本发明实例提出一种PH450酶的大量制备方法，包括如下步骤： S10,将蓝藻进行大量培养，并在培养过程中用PH450酶诱导剂进行诱导； S20,步骤S10的大量培养完成之后，提取蓝藻细胞总蛋白； S30,以人PH450酶作为抗原进行免疫反应，制备多克隆抗体； S40,以多克隆抗体作为亲和介质制备亲和层析柱； S50,将步骤S20提取的蓝藻细胞总蛋白于步骤S40的亲和层析柱进行过柱。
[0010] 本发明的上述方法，其制备的过程以蓝藻大量诱导培养，在蓝藻代谢的过程中大 量产生细胞修饰的PH450酶，其具有完全的生物活性结构；然后再用层析柱的方式，用免疫 制备的能与PH450酶特异性结合的多克隆抗体进行分离和收集，便可以在保持高活性的基 础上直接得到纯度较高的PH450酶相比现有的方法不需要进行繁琐的化学提纯步骤，更加 简便。
[0011] 而其中上述发明实施的过程中，基于蓝藻是具有大量色素合成的原核细胞，其自 身代谢中就具有较多的PH450酶，并且进一步采用诱导的方式进一步提升大量表达产生 PH450酶量；同时蓝藻相比人肝细胞、植物细胞，更容易在体外进行大量培养和扩增，而且 其代谢过程表达的蛋白类型较人肝细胞、植物细胞更少，更利于产物的分离和纯化。之后， 再采用人PH450酶作为抗原进行免疫反应，就可以得到针对人PH450酶产生的特异性亲和 吸附的多克隆抗体。
[0012] 而进一步上述人PH450酶作为抗原产生的特异性多克隆抗体，能进行特异性吸附 分流蓝藻的PH450酶其机理在于，不同的物种之间的细胞色素CYPH450超家族是从一个共 同祖先基因衍生进化而来，虽然不同种属间CYPs的一级氨基酸序列差异大，但其螺旋结 构和疏水性特征存在高度保守性，最终蛋白的三维结构是具有非常高的相似度的；经典的 PH450C末端的血红素结合区，有一高度保守的F22G222G2G结构，这一基元（motif)常被用 作鉴定PH450蛋白的主要特征。与膜结合的微粒体PH450N末端有一疏水序列作为跨膜信 号，在此疏水序列内有三个区域（氨基酸带负电荷），紧接此区还有一富含Pro的区域也相 当保守，在所有生物中具有同源性不同PH450形成螺旋倾向的位置十分匹配。比如，图1所 示的是人类CYP2C9 (PH450酶系中的一个大亚型)与细菌CYPH450BM3晶体结构的重叠图； 从图1中可以看出人所表达的CYP2C9与细菌表达的CYPH450BM3在蛋白质的三维结构空 间结构簇上是几乎完全相同的。所以本发明基于人PH450酶免疫得到的特异性抗体，也能 够特异性吸附蓝藻大量产生的PH450酶。
[0013]在上述基础上，采用免疫亲和层析的方式分离得到的蓝藻PH450酶，是在蓝藻中 表达后的经过细胞功能修饰之后的得到的具有成熟螺旋结构和活性构象的PH450酶，相比 PH450酶基因工程菌的方式在体外进行大量表达获得的PH450酶具有更好的品质。
[0014] 其中，上述步骤S10中对蓝藻进行培养，培养过程的实施方式采用BG-11培养基即 可，当然培养的过程中，为了在短期内获得大量的诱导培养物，可以采用光照通气培养和摇 床培养进行；通气培养可以通C02或洁净的空气，视培养物的多少来决定通气栗的大小，在 通气的硅胶管中设置一个缓冲瓶，塞上灭菌后的脱脂棉，帮助净化空气，如果对通气有更高 的要求，可以在通气管中加上一层滤膜。
[0015] 培养的过程中，同时培养的过程中进一步用诱导剂提升蓝藻 PH450酶的表达量，根据现有的不同的亚型所对应的最适诱导剂类型的表： | 齡 |: j ：| | | | 在培养的过程中采用利福平和依非韦伦两者结合进行诱导，因为2C系列和3A系列是PH450酶中占比量最多（其中3A亚型占30%左右、2C系列亚型占比12%左右）的两个亚型； 采用利福平和依非韦伦这两种诱导物质进行诱导，利福平是多种亚型的诱导剂、而依非韦 伦有利于诱导产生最大量的3A4亚型，所以采用这两种诱导剂基本上没有太多相互干扰， 且能得到PH450酶诱导类型和量的良好的效果。如果在更加多样的诱导剂成分，可能会导 致相互干扰。代谢过程中按照0. 2~lmmol/L的利福平、以及0. 1~0. 4mmol/L的依非韦伦进 行即可，太过量的浓度也会是细胞毒素，诱导之后其会慢慢被蛋白包被和降解，对大量培养 影响不大。
[0016] 其中，在诱导的过程中，由于蓝藻自身具有PH450酶的表达基因，且自身也需要进 行色素的合成和代谢，所以自身一般能自行采用基本营养物质合成而不需要引发。但是在 实施培养诱导的过程中，由于蓝藻是原核细胞，生命代谢比较简单缓慢，所以实施的过程 中，需要加速引发。引发的方式可以采用向培养基中添加瑞格列奈进行，因为瑞格列奈是 3A4和2C8这两种亚型的最合适的合成底物，采用之后加快形成蓝藻中