离血浆，一般一只家兔可放血40mL左右；将取 得的血液放入预先装有抗凝剂的容器，充分混勾后，1000rpm4°C离心5min，取出上清即 为血浆；S35,从步骤S34的兔血浆中取出10mL，提取多克隆抗体； 用pH7. 0的PBS缓冲液稀释5倍待用；取出ProteinG柱（lml)，先用pH7. 0的PBS缓 冲液冲洗，直至蛋白核酸检测仪显示的数据达到基线；取出PH7.0的PBS缓冲液稀释的大鼠 血浆溶液，以〇. 5ml/min的流速上ProteinG柱，上样完成后用pH7. 0的PBS缓冲液冲洗 至基线，收集流穿液；当然，这一个步骤中收集的流穿液中也可能还含有尚未被吸附的多克 隆抗体，所以该流穿液可以重复多次过柱，以降低多克隆抗体的浪费； 用pH2. 5Gly-HCl缓冲液冲洗介质，接收洗脱蛋白溶液，即为针对人PH450酶的多克隆 抗体，然后立即调节pH值至中性；测定A280nm以及A260nm，估算蛋白浓度；对洗脱蛋白溶 液进行SDS-PAGE分析。
[0031] S40,制备多克隆抗体亲和柱： S41，获取S印haroseCL4B介质（购自上海源叶生物CASNo. 61970-08-9); S42,然后将步骤S41的S印haroseCL4B介质，用去离子水500mL清洗，抽干成湿饼 状(沉降体积为约45mL)，转移到200mL烧杯中；凝胶悬浮在100mL去离子水中，用磁力 搅拌棒轻轻搅拌； S43，取4. 2gCNBr溶解在50mlHPLC级乙腈中，加入到凝胶悬液中，放入pH探头，用 20%的NaOH维持反应混合物的pH在11. 0,整个系统处于冰浴中，温度维持0°C;反应10~15 min时，检查CNBr是否全部溶解。此时，NaOH消耗速度将减少；pH稳定在11. 0后，反应混合 物倾入预冷的砂芯玻璃漏斗中，用1L冰冷的去离子水和500mL冰冷的偶联缓冲掖（pH8. 5， 0. 1MNaHC03)快速地洗涤凝胶，由于活化载体的不稳定性，凝胶必须立即偶联蛋白质或配 基； 滤出液用500mLO. 1MFeS04中和没反应的CNBr，倒入废液缸； S44,用pH8. 5的0. 1MNaHC03透析从步骤S35制备获得的洗脱蛋白溶液（即免疫步骤 中分离的人PH450酶多抗)，并与介质混合，4°C环境下均匀混合35h;加入乙醇胺0. 5ml， 4°C环境下振荡5h;用pH7. 0,0. 01M的PBS缓冲液清洗介质后，装柱。
[0032] S50,上样过柱： S51，将步骤S23的制备的蛋白样品取20ML，加入980W10mMPBS;使用公式：C(mg/ml)=l. 45xA2ffflnm-0. 74xA26()rJ^算样品的蛋白浓度；根据估算的浓度取约含1mg待测样 品备用； 552, 取S印haroseCL4B介质制备一空白层析柱，将步骤S51制备的待测样品上10mM 的PBS平衡过的空白层析柱后，并用PBS清洗3个体积收集流穿液； 553, 将步骤S，52中用空白层析柱初步过滤之后收集的流穿液，上10mM的PBS平衡过 的步骤S44制备的层析柱；并用PBS冲洗介质3~4个柱体积，接收各流穿溶液(该流穿液可 以再次进行过柱，并重复2~3次）； 554, 将步骤S53过柱之后的亲和层析柱用咪唑洗脱液进行洗脱，收集洗脱组分。
[0033] 为了验证这一结果，本发明中继续进行下述过程： S60,然后将步骤S54中获得的洗脱液进行SDS-PAGE电泳银染，当然重复做3个对照， 其SDS-PAGE电泳银染的结果图如附图2所示。从图2的电泳结果中，根据分子标记条带M 的分子量指示和条带1-3的染色情况，说明有蓝藻PH450酶产生，同时1-2条带中有2个亮 色条带，且条带3中拖带比较多，估计原因一方面是亚型种类不同可能会有分子量的不同， 一方面可能蛋白被分解。
[0034] 并且，以上采用的是10mL的小层析柱进行的实验，用大的层析柱将1L的蓝藻细胞 培养液(细胞和培养液的混合)，全部提取之后，能收获到2~6mg的蓝藻PH450酶；相比通过 构建生物工程菌的方式生产的发酵液中1L发酵液能有大概100~200mg左右的PH450酶； 相比而言，本发明的产量比工程菌发酵生产的产量低很多，但是其本身是基于诱导产生，而 且制备的是修饰后的具有完整生物活性的PH450酶，其性能和品质上是具有绝对优势的， 而且分离制备的过程中，只需一次过柱之后洗脱浓缩即可，而不需要进行多种化学除杂、萃 取、纯化等复杂的工艺，所以基本达到这样的产率，在成本和收益上还是比较可观的。当然， 其用途上由于存在种属的不同，或许在作为蛋白药物进行使用时可能不太适合，但是如果 作为化妆品的活性添加成分，清除脸部色素等等用途上，是完全能满足产品需求的。
[0035] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种PH450酶的大量制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 获取蓝藻并进行大量培养，并在培养过程中用PH450酶诱导剂进行诱导； 在所述大量培养结束后收集蓝藻细胞，提取蓝藻细胞总蛋白； 用人PH450酶作为抗原进行免疫反应，制备多克隆抗体； 以所述多克隆抗体作为亲和介质制备亲和层析柱； 将所述提取的蓝藻细胞总蛋白于所述亲和层析柱进行过柱。2. 如权利要求1所述的PH450酶的大量制备方法，其特征在于，获取所述蓝藻并进行大 量培养，并在培养过程中用PH450酶诱导剂进行诱导步骤中，所述PH450酶诱导剂包括利福 平和依非韦伦。3. 如权利要求2所述的PH450酶的大量制备方法，其特征在于，所述利福平在蓝藻培养 基中的浓度为〇. 2~lmmol/L; 和/或，所述依非韦伦在蓝藻培养基中的浓度为〇. l~〇. 4mmol/L。4. 如权利要求1至3所述的PH450酶的大量制备方法，其特征在于，获取所述蓝藻并进 行大量培养，并在培养过程中用PH450酶诱导剂进行诱导步骤中，还包括： 向蓝藻培养基中添加瑞格列奈。5. 如权利要求1至3任一项所述的PH450酶的大量制备方法，其特征在于，以所述多克 隆抗体作为亲和介质制备亲和层析柱步骤中， 所述亲和层析柱采用的固相基质为Sepharose CL 4B。6. 如权利要求1至3任一项所述的PH450酶的大量制备方法，其特征在于，将所述提取 的蓝藻细胞总蛋白于所述亲和层析柱进行过柱步骤之前，还包括： 将所述提取的蓝藻细胞总蛋白进行梯度沉降处理。7. 如权利要求1至3任一项所述的PH450酶的大量制备方法，其特征在于，将所述提取 的蓝藻细胞总蛋白于所述亲和层析柱进行过柱步骤之前，还包括： 将所述提取的蓝藻细胞总蛋白用不含有所述多克隆抗体的空白层析柱进行过柱。8. 如权利要求1至3任一项所述的PH450酶的大量制备方法，其特征在于，将所述提取 的蓝藻细胞总蛋白于所述亲和层析柱进行过柱步骤之后，还包括： 用洗脱液对所述亲和层析柱进行洗脱，并收集洗脱组分； 将所述洗脱组分进行浓缩处理。
【专利摘要】本发明提供了一种PH450酶的大量制备方法，包括：获取蓝藻并进行大量培养，并在培养过程中用PH450酶诱导剂进行诱导；在大量培养结束后收集蓝藻细胞，提取蓝藻细胞总蛋白；用人PH450酶作为抗原进行免疫反应，制备多克隆抗体；以多克隆抗体作为亲和介质制备亲和层析柱；将提取的蓝藻细胞总蛋白于所述亲和层析柱进行过柱。本发明上述PH450酶的大量制备方法，基于蓝藻和人PH450酶在蛋白质的三维结构、活性功能几乎完全相同，且蓝藻代谢简单、易于诱导和分离的情形，将蓝藻诱导培养产物用PH450酶的特异性抗体进行亲和层析；相比现有的基因工程菌发酵制备的方法，本发明大量制备的PH450酶是蓝藻细胞代谢中产生的活性酶，品质比较好具有活性；而且纯化分离过程简单，方法的效益更高。
【IPC分类】C12N9/02
【公开号】CN105112378
【申请号】CN201510533850
【发明人】沃纳·阿尔伯
【申请人】深圳无斑时代科技有限公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年8月27日