37 °C恒温C02培养箱中培养； 2) 培养24h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为200ML的含有不同浓度待测 样品的新鲜基础培养基，并以PBS为阴性对照，于37 °C恒温C02培养箱中培养； 3) 48h后吸出药液，用PBS洗板2次，加入5mg/mL的MTT溶液20W和新鲜基础培 养基180ML;于37 °C恒温C02培养箱中继续培养； 4) 4h后，弃去含有MTT的培养液，加入150WDMS0后于微型振荡器上振荡15min， 490nm波长处测定光密度值并计算抑制率： 癌细胞生长抑制率（%)=((对照组0D-空白组0D)-(给药组0D-空白组0D))八（对照 组0D-空白组0D) )X100 应用实施例1 五种肿瘤细胞MCF-7、IfepG-2、SGC-7901、A549和HT-29及人正常肝细胞L-02各100ML细胞悬液（5X104个/mL)，加至96孔板中，于37 °C恒温C02培养箱中培养.24h后 细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为200ML的500Pg/mL的多肽样品的新鲜基础培 养基，并以PBS为阴性对照，于37 °C恒温C02培养箱中培养.48h后吸出药液，用PBS洗 板2次，加入5mg/mL的MTT溶液20W和新鲜基础培养基180ML;于37 °C恒温C02培 养箱中继续培养；4h后，弃去含有MTT的培养液，加入150WDMS0后于微型振荡器上振 荡15min，490nm波长处测定光密度值并计算抑制率，结果见图2。
[0015] 应用实施例2 四种肿瘤细胞A549、IfepG-2、HT-29 和SGC-7901 悬液（5X104个 /mL)各 100ML,加 至96孔板中，于37 °C恒温C02培养箱中培养，24h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终 体积为200ML的31. 25l^g/mL的多肽样品的新鲜基础培养基，并以PBS为阴性对照，于37 °C恒温C02培养箱中培养，48h后吸出药液，用PBS洗板2次，加入5mg/mL的MTT溶液 20W和新鲜基础培养基180ML;于37 °C恒温C02培养箱中继续培养；4h后，弃去含有 MTT的培养液，加入150WDMS0后于微型振荡器上振荡15min，490nm波长处测定光密 度值并计算抑制率。由表1可知，31. 25lVmL的多肽对肿瘤细胞A549、IfepG-2、HT-29和 SGC-7901 的抑制率分别是 22. 17%、17. 57%、3. 22% 和 20. 75%。
[0016] 表1
应用实施例3 四种肿瘤细胞A549、IfepG-2、HT-29 和SGC-7901 悬液（5X104个 /mL)各 100ML,加 至96孔板中，于37 °C恒温C02培养箱中培养.24h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入 终体积为200ML的62. 5Pg/mL的多肽样品的新鲜基础培养基，并以PBS为阴性对照，于37 °C恒温C02培养箱中培养.48h后吸出药液，用PBS洗板2次，加入5mg/mL的MTT溶 液20W和新鲜基础培养基180ML;于37 °C恒温C02培养箱中继续培养；4h后，弃去含 有MTT的培养液，加入150WDMSO后于微型振荡器上振荡15min，490nm波长处测定光 密度值并计算抑制率。由表1可知，62. 5Pg/mL的多肽对肿瘤细胞A549、IfepG-2、HT-29和 SGC-7901 的抑制率分别是 27. 51%、21. 11%、18. 77% 和 23. 42%。
[0017] 应用实施例4 四种肿瘤细胞4549、11印6-2、111'-29和36(：-7901悬液（5\104个/11^)各100虬，加至 96孔板中，于37 °C恒温C02培养箱中培养.24h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体 积为200ML的125l^g/mL的多肽样品的新鲜基础培养基，并以PBS为阴性对照，于37 °C恒 温C02培养箱中培养.48h后吸出药液，用PBS洗板2次，加入5mg/mL的MTT溶液20 耵和新鲜基础培养基180ML;于37 °C恒温C02培养箱中继续培养；4h后，弃去含有MTT 的培养液，加入150WDMS0后于微型振荡器上振荡15min，490nm波长处测定光密度值 并计算抑制率。由表1可知，125Pg/mL的多肽对肿瘤细胞A549、IfepG-2、HT-29和SGC-7901 的抑制率分别是 59. 42%、29. 23%、29. 23% 和 28. 06%。
[0018] 应用实施例5 四种肿瘤细胞4549、11印6-2、111'-29和36(：-7901悬液（5\104个/11^)各100虬，加至 96孔板中，于37 °C恒温C02培养箱中培养.24h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体 积为200ML的250Pg/mL的多肽样品的新鲜基础培养基，并以PBS为阴性对照，于37 °C恒 温C02培养箱中培养.48h后吸出药液，用PBS洗板2次，加入5mg/mL的MTT溶液20 耵和新鲜基础培养基180ML;于37 °C恒温C02培养箱中继续培养；4h后，弃去含有MTT 的培养液，加入150WDMS0后于微型振荡器上振荡15min，490nm波长处测定光密度值 并计算抑制率。由表1可知，250l^g/mL的多肽对肿瘤细胞A549、IfepG-2、HT-29和SGC-7901 的抑制率分别是 65. 07%、63. 02%、52. 43% 和 39. 88%。
【主权项】
1. 一种十三肽，其特征是该合成十三肽的氨基酸序列为Tyr-Gly-Phe-Val-Met-Pro-A rg-Ser-Gly-Leu-Trp-Phe-Arg〇2. 权利要求1所述一种十三肽的应用，其特征在于将终浓度为30-500呢/mL的所 述十三肽与肿瘤细胞H印G-2、SGC-7901、A549和HT-29混，孵育48 h后，对四种肿瘤细 胞 HepG-2、SGC-7901、A549 和 HT-29 的抑制率分别为 17. 57%-71. 79%、20. 75%-51. 55%、 22. 17%-76. 06% 和 3. 22%-57. 27%。3. 权利要求1所述一种十三肽的应用，其特征在于将浓度为500Pg/mL的所述十三肽 与五种肿瘤细胞MCF-7、H印G-2、SGC-7901、A549和HT-29混，孵育48 h后，对A549和IfepG-2 的体外增殖抑制作用最强，抑制率分别为76. 06%和71. 79% ;其次为HT-29、SGC-7901和 MCF-7,其抑制率分别为 57. 27%、51. 55% 和 46. 68%。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述十三肽对A549、IfepG-2、SGC-7901 和 HT-29 的半数抑制浓度 IC50 值分别为 104. 05Pg/mL、188. 23Pg/mL、247. 32Pg/mL 和 446. 72Kg/mL。5. 根据权利要求3所述的应用，，其特征在于用浓度为500呢/mL所述十三肽处理正 常肝细胞L-〇2后，肝细胞L-〇2增殖9%。6. 权利要求1所述的十三肽在制备生物医药中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种十三肽及其应用，该合成多肽的氨基酸序列如下所示：Tyr-Gly-Phe-Val-Met-Pro-Arg-Ser-Gly-Leu-Trp-Phe-Arg，缩写为YGFVMPRSGLWFR，分子量1614.9，纯度96.3%。本发明的多肽使用多肽合成仪，采用固相合成法合成。本发明提供了一种具有体外抗肿瘤活性、对人正常肝细胞有一定的促进增殖作用的合成多肽，可应用于生物制药领域。
【IPC分类】A61P35/00, A61K38/10, C07K7/08
【公开号】CN105131089
【申请号】CN201510631209
【发明人】张学武, 王竹君
【申请人】华南理工大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年9月28日