br>[0069] 7) 14000g，室温，离心lmin，使细胞碎片沉淀于离心管底部，取上清转移到另外一 个不含RNA酶1. 5mL的离心管中；
[0070] 8)加入450ul的95%乙醇，涡旋混匀；
[0071] RNA 吸附：
[0072] 9)取650ul含乙醇的裂解液加到离心柱中，14000g离心lmin ;
[0073] 10)弃下层，重置收集管于柱上；
[0074] 11)依照裂解液的容量，重复9)~10)步；
[0075] 12)加入 400ulWash solution，14000g 离心 2min ;
[0076] 13)弃下层，将柱置于一新的收集管上；
[0077] DNase 处理：
[0078] 14)加入 lOOulEnzyme Incubation Buffer 和 15ulDNase I，14000g 离心 lmin ;
[0079] 15)将收集管中的溶液重新移入柱中；
[0080] 16)室温放置 15min ;
[0081] RNA 洗涤：
[0082] 17)加入400ulWash solution，14000g离心lmin，弃下层，重置收集管于柱上；
[0083] 18)加入 400ulWash solution，14000g 离心 2min，弃收集管；
[0084] RNA 洗脱：
[0085] 19)把柱子放入 1. 7mL Elution 管中；
[0086] 20)加入 30ul Elution Buffer ;
[0087] 21) 200g离心2min，使溶液充分与柱结合，然后14000g离心lmin。
[0088] 2、RNA样品的质量分析（NanoDroplOOO分光光度计）
[0089] NanoDroplOOO 分光光度计检测 RNA 样品：0D260/0D280 为 1. 8-2. 2。
[0090] 3、基因芯片杂交及扫描
[0091] 总RNA经线性化扩增后，cy3-UTP标记，荧光标记后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit 纯化，用Amhion的RNA Fragmentation Reagents对标记好的cRNAs进行片段化处理。采用 美国Agilent公司的人全基因表达谱芯片（4x 44K基因），在芯片杂交炉中65°C杂交17h， 然后洗脱、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner扫描仪扫描。
[0092] 4、芯片数据处理与分析
[0093] 杂交后的芯片经芯片扫描仪读取数据点后，将数据导入分析软件，对于两组比值 的自然对数绝对值大于2. 0或小于0. 5的基因作为差异表达基因。
[0094] 5、统计学处理
[0095] 采用SPSS 13. 0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析法， P〈0. 05差异有显著性意义。
[0096] 6、结果
[0097] 结果显示（如图1所示），与正常人相比，骨关节炎患者滑膜组织中SLC5A8基因的 mRNA水平显著降低，差异具有统计学意义（P〈0. 05)。
[0098] 实施例2 0A滑膜组织和正常滑膜组织中SLC5A8蛋白的表达差异
[0099] 1、步骤
[0100] 1. 1滑膜组织细胞体外培养
[0101] 将无菌获取的滑膜组织用PBS清洗后，用无菌手术剪刀反复剪切成约1mmX1mmX 1mm的组织块，加入胶原酶II (0. 5mg/ml) 37°C、消化2h后，经200目纱网过滤，离心去上清 后，将细胞重悬于DMEM培养液，置于37°C，5 % C02细胞培养箱内培养。当细胞长成梭形并 成片后，进行传代培养。当细胞传至第3代后，分别加入FITC标记的小鼠抗人CD3、CD14、 ⑶19和PE标记的小鼠抗人⑶1 lb进行标记，流式细胞仪检测鉴定。上述4种标记均为阴性 的细胞为成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-like Synoviocytes，FLS)用于本研究。
[0102] 1. 2细胞总蛋白的提取
[0103] 取对数期生长良好的纤维样滑膜细胞进行细胞总蛋白的提取，按照EpiQuik全细 胞提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。
[0104] 1. 3Western blot 检测
[0105] 将提取的蛋白定量进行SDS-PAGE电泳，之后进行转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵 育、显色。
[0106] 2、统计学处理
[0107] 将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以0 -actin为内参，将SLC5A8 蛋白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值土标准差的方式来表示，采用 SPSS13. 0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P〈0. 05时具有 统计学意义。
[0108] 3、结果
[0109] 结果如图2所示，与正常人相比，骨关节炎滑膜组织中SLC5A8蛋白的表达水平显 著降低，差异具有统计学意义（P〈〇. 05)。
[0110] 实施例3 SLC5A8基因表达质粒构建
[0111] USLC5A8基因表达载体的构建
[0112] 根据SLC5A8基因的编码序列（如SEQ ID NO. 1所示）设计扩增引物，引 物序列如下：正向引物为5' -GGCATCGGCACCTTCGTG-3'（SEQ ID N0. 3)，反向引物为 5'-AAACGAGTCCCAITGCTCTT-3'（SEQ ID N0.4)。从成人胎脑的 cDNA 文库（clontech 公 司，货号：638831)中扩增全长的SLC5A8基因的编码序列，上述cDNA序列经限制性内切酶 BamHI和Xhol双酶切后插入到经限制性内切酶BamHI和Xhol双酶切的真核细胞表达载体 pcDNA3. 1中，连接获得的重组载体pcDNA3. 1-SLC5A8用于后续实验。
[0113] 2、转染
[0114]将0A成纤维样滑膜细胞分为两组，分别为对照组（转染pcDNA3. 1空载体）、和 SLC5A8过表达组（转染pcDNA3. 1-SLC5A8)。使用脂质体2000进行载体的转染，具体转染方 法按照说明书的指示进行。pcDNA3. 1空载体和pcDNA3. 1-SLC5A8的工作浓度均为0. 5 y g/ ml 〇
[0115] 3、QPCR 检测
[0116] 3. 1提取细胞总RNA利用常规方法进行操作。
[0117] 3. 2逆转录
[0118] 用逆转录缓冲液对1 y g总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25 y 1反应体系，每 个样品取1 y g总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5 X逆转录缓 冲液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30ymmol/l Oligo dT，200U/yl M-MLV，模板 RNA。 42°C孵育lh，72°C 10min，短暂离心。
[0119] 3.3QPCR
[0120] 采用25 y 1反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以 保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12. 5 y 1，正向引 物（5yM)lyl，反向引物（5yM)lyl，模板cDNA 2.0yl，无酶水8.5yl ;扩增SLC5A8基因 的正向引物序列为5'-0厶60厶(：〇^厶厶16厶6厶0厶-3'（5￡0 10勵.5)，反向引物序列为5'-厶八6八 ATACCAGTTATCCATCAGT-3'（SEQ ID N0. 6);扩增 GAPDH基因的正向引物序列为 5'-TTTAACTC 10勵.8)，各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95￡€5!^11，（95°(：1〇8,6〇 1€6〇8)*45个循 环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反