一种单分子测序芯片的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及DNA测序芯片技术领域，具体涉及一种单分子测序芯片。
【背景技术】
[0002]进入21世纪后，人类基因组计划的完成对当代的生物学研究和医学研究产生了巨大的影响。就基因序列分析而言，后基因组时代的重点已由单个物种的全基因组序列测定转移到了对某一物种在基因组DNA序列层次上对个体遗传差异及物种间遗传差异的比较。靶向基因重测序将会是未来临床基因检测的主流技术。单分子测序技术被誉为第三代测序技术，其显著特征是可以高保真地对DNA片段直接进行识别，单分子测序技术由于能识别到单个核酸分子，其具有比高通量测序技术(统称为二代测序技术)更高的检测灵敏度。
[0003]基因芯片是测序技术得以实现的关键部件。然而，二代测序芯片是目前市场上的主流产品，它们大多是采用半导体纳米加工工艺得到高密度的纳米阵列，加工工艺精细且复杂，成本非常高，且需要大型的高精度仪器和超高级别的洁净室来完成。另外，二代测序芯片为了实现高通量的测序目的，芯片通道的宽度通常较大，在负压抽液方式进样进行生化反应时，通常会存在流体的流场分布不均问题和盖玻片易变形的问题。流场分布不均问题会造成试剂切换不干净，并使生化反应受影响，盖玻片变形会影响芯片的质量，更会影响碱基光学信号的采集。
[0004]单分子测序技术由于在测序数据量上要求不高，无需像二代测序芯片要求超高密度的纳米阵列，因此传统的二代测序芯片已无法匹配单分子测序技术，所以，有必要提供一种适用于单分子测序的芯片。
【发明内容】
[0005]鉴于此，本发明提供了一种单分子测序芯片，所述单分子测序芯片的流场分布情况良好，芯片的变形率低，流体的冲刷切换彻底。
[0006]本发明提供了一种单分子测序芯片，所述单分子测序芯片包括基片和所述基片压合设置的基底层，所述基片包括相对设置的第一表面和第二表面，所述基片第一表面间隔设置有多个流道形成的反应池阵列，每个所述流道相对设置的两个侧壁沿所述流道的长度方向延伸并在所述流道的两端交汇形成两个带有夹角的锥形末端，所述两个锥形末端表面分别设置有与所述基片第二表面连通的流体输入孔和流体输出孔，所述基底层包括透明基底和设置在所述透明基底表面的间隔层，所述间隔层与所述基片第一表面接触且所述间隔层对应所述流道所在的位置设置有腐蚀凹槽。
[0007]优选地，所述反应池阵列包括15-25个流道。
[0008]优选地，所述间隔层沿与所述流道的长度方向垂直的方向之间的宽度为1-1.5mm。
[0009]如本发明所述的，相邻流道之间的间距为1-1.5mm。
[0010]优选地，所述锥形末端的夹角为30-60°。
[0011]优选地，每个所述流道相对设置的两个侧壁的交汇处的距离为每个流道的长度，每个所述流道的长度为50-75mm。
[0012]优选地，每个所述流道相对设置的两个侧壁之间的距离为每个流道的宽度，每个所述流道的宽度为I_2mm。
[0013]优选地，每个所述流道的深度为0.6-lmm。
[0014]将流道的深度优选为0.6-1_，根据矩形流道流体力学阻力规律，厚度方向每增加一倍，流阻降低为原来的1/8，小的流阻，有利于流体的流动，便于单分子测序过程中，流体在流道内进行生化反应。
[0015]更优选地，每个流道的长度50_，宽度为1mm，深度为0.6_。
[0016]在流体上来说，宽度更窄的流道更有利于流体间的冲刷切换，将流道两端的纵截面设计成为三角形，当流体流过该流道内，可使流道内不存在回流现象。
[0017]优选地，所述基片具有与所述流道的长度方向垂直的第一边长，每个流道相对设置的两个侧壁的交汇处距所述基片的第一边长的距离为0.5-lcmo
[0018]优选地，所述流体输入孔和流体输出孔同轴。
[0019]优选地，所述流体输入孔的孔径大小为300-500 μ m0
[0020]优选地，所述流体输出孔的孔径大小为300-500 μ m。
[0021]如发明所述的，所述基片第一表面间隔设置有多个流道组成单分子测序芯片的反应池阵列，每个流道的两个锥形末端表面开设有流体输入孔和输出孔，以供流体的流入与流出。
[0022]如本发明所述的，所述流体输入孔和流体输出孔用于连接流体的输入、输出装置，例如，可以在所述流体输入孔和流体输出孔分别插上移液枪头、管接头等，以分散每个流道内流体的输入点、输出点，便于每个流道内流体的输入、输出不受干扰。
[0023]优选地，所述基片的材质包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、EVA(乙烯-醋酸乙烯)和PUA(聚胺脂)中一种或多种，但不限于此，只要能实现浇筑工艺即可。
[0024]优选地，所述透明基底包括表面带有官能团为环氧基、氨基、羧基、巯基和醛基中的一种的透明的玻璃、石英或有机聚合物材料。
[0025]更优选地，所述透明基底为表面带有环氧基的透明玻璃或石英。
[0026]优选地，所述间隔层的材质为聚甲基戊二酰亚胺(PMGI)。所述间隔层用于阻隔各流道内的样本之间的接触，保证每个流道内样本的单独控制。
[0027]优选地，所述间隔层是向每个流道内注入试剂以清洗掉与各流道接触的透明基底上的聚甲基戊二酰亚胺层，以使透明基底上表面带有的官能团(环氧基、氨基、羧基、巯基和醛基等)暴露出来。所述间隔层用于阻隔各流道内的样本之间的接触，保证每个流道内样本的单独控制。
[0028]优选地，所述腐蚀凹槽的深度为1-5 μ m。
[0029]所述透明基底表面的官能团(如环氧基、氨基、羧基、巯基和醛基)，可与单分子测序仪的基因样本的官能团(如羧基、磷酸基、氨基等)发生作用，使得基因样本(如DNA、RNA)固定在芯片的透明基底上，从而便于测序的进行。如透明基底上的环氧基可与修饰有_順2的DNA发生化学反应，通过新的-CH2-NH-键将待测序的DNA单链固定在修饰有环氧基团的基底表面。
[0030]所述单分子测序芯片在应用时，在下层透明基底的外部设有荧光检测器，荧光检测器为光电耦合器件CCD或互补性氧化金属半导体CMOS中的一种。经过微流体通道中的生化反应，可用多种光学波长来检测固定在透明基底上的DNA分子中某一特定位置的碱基，从而确定固定在透明基底上的DNA序列。
[0031]本发明提供的单分子测序芯片具有一定数目的流道，每个流道带有夹角的锥形末端，可使流道内流体的流场分布情况良好，流道内不存在回流现象，流场分布情况远好于二代测序芯片，同时集成化的多流道的设计增加了基底的支撑点，基底的变形问题几乎可以忽略。该单分子测序芯片可以实现每个流道内样本的单独控制，保证了样本间无交叉污染，同时可以简化后期数据处理工作。另外，该单分子测序芯片无需像二代测序芯片中，在每个样本进样之前都要加入特定的一段序列“barcode”，以便从测序之后的生物信息分析可以识别出每个样本。
[0032]本发明提供的所述单分子测序芯片的制备方法，包括以下步骤:
[0033](I)取一基板，根据设计好的反应池阵列的图形模板，采用光刻法在基板的表面制作反应池阵列的阳膜；
[0034](2)用模型胶浇注所述阳膜，经过真空除气后，在90-100°C下固化l_3h，使所述反应池阵列的阳膜转移在所述模型胶的底部，揭膜，得到带有多个流道的模型胶层，并在每个流道的两端各打一个孔，形成流体输入孔和流体输出孔，得到基片；
[0035](3)基底修饰:取一透明基底，在所述透明基底的表面制备一聚甲基戊二酰亚胺(PMGI)层，得到表面修饰的透明基底；
[0036](4)封装芯片:将上述基片与所述表面修饰的透明基底进行氧等离子体清洗，之后将所述基片与透明基底压合形成容纳流体的空间；然后往每个流道内注入N-甲基吡咯烷酮(简写为NMP)，反应时间为10min-15min，以清洗掉与各流道接触的聚甲基戊二酰亚胺层，得到位于所述透明基底表面的间隔层，完成单分子测序芯片的制作，所述单分子测序芯片包括基片和所述基片压合设置的基底层，所述基片包括相对设置的第一