一种以黑果枸杞为原料制备矮牵牛素-3-o-芸香糖(反式-香豆酰基)-5-o-葡萄糖苷的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及从茄科枸杞属黑果枸杞果实中提取相关成分的技术领域，具体涉及一 种制备具有显著抗氧化活性矮牵牛素-3-0-芸香糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷的 方法。
【背景技术】
[0002] 黑果枸杞为前科枸杞属多年生灌木，主要分布于我国陕西北部黄土高原、宁夏、甘 肃、青海、内蒙古、新疆和西藏等地区，中亚、高加索和欧洲等地区亦有分布。其中，我国新 疆、甘肃分布较多，且主要分布于新疆塔里木下游地区，属于典型的荒漠植物，而甘肃则主 要分布于河西走廊地区、黑河流域沿岸及其湿地地区。《维吾尔药志》记载，黑果枸杞果实具 有强肾、润肝、明目、健胃、补脑、抗衰老及通经作用。《晶珠本草》记载，黑果枸杞用于治疗心 热病、心脏病、月经不调、停经等且药效显著，民间作为滋补强壮、降压药用。黑果枸杞果实 里富含的花青素由于其卓越的保健养生功效，近年来也成为研究的热点。
【发明内容】
[0003] 本发明旨在从黑果枸杞中高效、便捷地制备具有强抗氧化活性矮牵牛素-3-0-芸 香糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷，实现本发明的具体方案如下：
[0004] (1)取黑果枸杞干以1 : 40料液比用体积分数80%乙醇（含0· 1 %甲酸）在50°C 条件下水浴浸提3h;
[0005] (2)将步骤（1)得到的黑果枸杞粗提液在4000rpm的离心机里离心3min;
[0006](3)将步骤（2)得到的离心上清液加入到旋蒸瓶中旋蒸，旋蒸温度控制在45°C，旋 蒸至较浓稠的紫黑色液体；
[0007] (4)将步骤（3)的旋蒸液加10mL上样于用AB-8大孔树脂填充的层析柱 (5X30cm)；
[0008](5)将步骤（4)所得带有颜色的收集液集中到旋蒸瓶中旋蒸，旋蒸温度为40°C，旋 至较浓稠的紫黑色液体，用〇. 1%的TFA溶液稍加稀释；
[0009] (6)将步骤（5)得到的旋蒸液过膜，向AKTAPurifier蛋白纯化系统进样lmL，通 过配制的流动相（4%甲醇、19%乙腈、1%甲酸的水溶液）和YMC-Pack0DS-A柱分离纯化样 品；
[0010] (7)将步骤（6)所分离出的样品旋蒸，冷冻干燥即为高纯度的矮牵牛素-3-0-芸香 糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷；
[0011] (8)将步骤（7)所得矮牵牛素-3-0-芸香糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷用 去离子水分别配制成一系列浓度梯度的样品溶液，测定其对DPPH自由基和超氧阴离子自 由基的清除能力；
[0012] 制备的矮牵牛素-3-0-芸香糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷冷冻干燥后为 紫红色粉末，该花色苷对DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除率呈现剂量依赖关系，清 除DPPH自由基的IC5Q= 32. 5μg/mL，清除超氧阴离子自由基的1C5。= 106. 5μg/mL。
【附图说明】
[0013] 图1黑果枸杞花青素粗提物高效液相色谱（HPLC-DAD)分析图
[0014] 图2矮牵牛素-3-0-芸香糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷的高效液相色谱 (HPLC-DAD)分析图
[0015] 图3矮牵牛素-3-0-芸香糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷一级质谱（MS)分 析图
[0016] 图4矮牵牛素-3-0-芸香糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷二级质谱（MS)分 析图
[0017] 图5矮牵牛素-3-0-芸香糖（反式-香豆酰基）-5-0葡萄糖苷对DPPH自由基的 清除作用分析图
[0018] 图6矮牵牛素-3-0-芸香糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷对超氧阴离子自 由基的清除作用分析图
【具体实施方式】
[0019] 下面通过实施例，对本发明作进一步描述。
[0020] 实施例1 :
[0021] (1)取黑果枸杞干以1 : 40料液比用体积分数80%乙醇（含0· 1 %甲酸）50°C水 浴浸提3h;
[0022] (2)将步骤（1)得到的黑果枸杞粗提液离心（4000rpm，3min);
[0023] (3)将步骤⑵得到的离心液的上清液倒入旋蒸瓶中旋蒸，旋蒸温度45°C，旋至较 浓稠的紫黑色液体；
[0024] (4)将步骤（3)所得粗提物上样10mL于AB-8大孔树脂填充的层析柱（5X30cm);
[0025] (5)将步骤（4)所得带有颜色的收集液集中到旋蒸瓶中旋蒸，旋蒸温度为40°C，旋 至较浓稠的紫黑色液体，用〇. 1 %的TFA溶液稀释；
[0026] (6)将步骤（5)所得的稀释液过膜，向AKTAPurifier蛋白纯化系统进样lmL，通 过配制的流动相（4%甲醇、19%乙腈、1%甲酸的水溶液）和YMC-Pack0DS-A柱分离纯化样 品；
[0027] (7)将步骤（6)所得的样品旋蒸，冷冻干燥即为高纯度的矮牵牛素-3-0-芸香糖 (反式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷；
[0028] (8)将步骤（7)所得矮牵牛素-3-0-芸香糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷 用去离子水分别配制成一系列浓度梯度（〇·〇1、〇· 02、0· 05、0· 10、0· 15、0· 20、0· 35、0· 50mg/ mL)的样品溶液，测定其对DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除能力；
[0029] 制备的矮牵牛素-3-0-芸香糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷冷冻干燥后为 紫红色粉末，该花色苷对DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除率呈现剂量依赖关系，清 除DPPH自由基的IC5Q= 32. 5μg/mL，清除超氧阴离子自由基的1C5。= 106. 5μg/mL。
[0030] DPPH·清除率（％ ) = [A。- (AfA2) ] /A。X100 %
[0031]A。组是以水代替样品溶液，A2组是以乙醇代替DPPH溶液，A3且是样品实验。
[0032] 超氧阴离子自由基清除率（％ ) = [Ao-afAiVAoXlOO%
[0033]A。组是以水代替样品，A2组是以磷酸盐缓冲液代替NBT溶液，A3且是样品实验。
[0034] 实施例2 :
[0035] 黑果枸杞中具有抗氧化活性的矮牵牛素-3-0-芸香糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡 萄糖苷的结构分析与鉴定
[0036] (1)对黑果枸杞花青素粗提物进行高效液相色谱分析
[0037] ①色谱条件：TSKgel 0DS-80TSQA色谱柱
[0038] ②检测条件：波长：530nm、280nm、柱温：35°C、进样体积：20 μ L
[0039] ③流动相及洗脱梯度：
[0040]
[0041] Α相：含15%甲醇的乙腈溶液Β相：1%甲酸、0. 1% TFA的水溶液
[0042] (2)对黑果枸杞花青素粗提物在AKTAPurifier蛋白纯化系统分离纯化分析
[0043]①色谱条件：YMC-Pack0DS-A柱
[0044] ②检测条件：波长：280nm、进样体积：lmL、流速：2ml/min、每管收集5mL
[0045] ③流动相配比：4%甲醇、19%乙腈、1%甲酸的水溶液
[0046] ④收集第9、10管的纯化物（紫红色）
[0047] (3)对纯化产物高效液相色谱分析（条件同步骤1)
[0048] (4)质谱分析
[0049] 质谱条件：Agilent液相色谱-质谱联用仪（包括Agilent1100高效液相色谱仪 和AgilentG24450型质谱仪）；电喷雾电离源，正离子检测，扫描范围m/z0~1000,雾化 气体为氮气，流速为2L/min，电离电压为4. 5kV，锥孔电压为25V，离子源温度250°C。
[0050] 结合一级质谱、二级质谱对样品分析，从图3、图4可分析出，样品分解过程为：MS/ MS:934/711/479/317,分析其基本构成为矮牵牛素花色苷，其5位连接一个葡萄糖苷键，其 3位连接一个芸香糖苷，芸香糖苷末端反式连接一个香豆酰基，最终鉴定该纯化产物为：矮 牵牛素-3-0-芸香糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷。
[0051] 综上所述仅为本发明的较佳施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依 本发明申请专利范围的内容所做的等效变化与修饰都应为本发明的技术范畴。
【主权项】
1. 一种以黑果枸杞为原料制备矮牵牛素-3-0-芸香糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡萄 糖苷的方法，其特征在于包括以下操作步骤： (1) 取黑果枸杞干以1 : 40料液比用体积分数80%乙醇（含0.1%甲酸）50°C水浴浸 提3h; (2) 将步骤（1)得到的黑果枸杞粗提液离心（4000rpm，3min) (3) 将步骤（2)得到的离心液的上清液倒入旋蒸瓶中旋蒸，旋蒸温度为45°C，旋至较浓 稠的紫黑色液体。 (4) 将步骤（3)所得粗提物上样10mL于AB-8大孔树脂填充的层析柱（5X30cm); (5) 将步骤（4)所得带有颜色的收集液集中到旋蒸瓶中旋蒸，旋蒸温度为40°C，旋至较 浓稠的紫黑色液体，用〇. 1 %浓度的TFA溶液稀释。 (6) 将步骤（5)所得稀释液过膜后向AKTAPurifier蛋白纯化系统进样lmL，通过配制 流动相（4%甲醇、19%乙腈、1 %甲酸的水溶液）和YMC-Pack0DS-A柱分离纯化样品； (7) 将步骤（6)所得的样品旋蒸，冷冻干燥即为高纯度的矮牵牛素-3-0-芸香糖（反 式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷。 (8) 将步骤（7)所得矮牵牛素-3-0-芸香糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷用去离 子水配制一系列浓度梯度溶液，测定其对DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除能力。 制备的矮牵牛素-3-0-芸香糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷冷冻干燥后为紫红色 粉末，该花色苷对DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除率呈现剂量依赖关系，清除DPPH 自由基的IC5Q= 32. 5μg/mL，清除超氧阴离子自由基的1C5。= 106. 5μg/mL。
【专利摘要】本发明涉及一种以黑果枸杞为原料制备矮牵牛素-3-O-芸香糖(反式-香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷的方法。通过乙醇浸提，离心取上清液，真空浓缩，AB-8大孔树脂柱层析纯化，AKTA？Purifier蛋白纯化系统与YMC-Pack？ODS-A柱进一步分离纯化，冷冻干燥即为高纯度(97％以上)的矮牵牛素-3-O-芸香糖(反式-香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷。采用体外清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基的方法分析矮牵牛素-3-O-芸香糖(反式-香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷的抗氧化活性，发现其具有显著的抗氧化活性。本发明从黑果枸杞中提取矮牵牛素-3-O-芸香糖(反式-香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷的方法具有提取效率高、重复性好、工艺温和等优点，制备的矮牵牛素-3-O-芸香糖(反式-香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷具有显著的抗氧化活性，因此在食品工业及医药行业具有广阔的应用前景。
【IPC分类】C07H17/07, C07H1/08, A61P39/06
【公开号】CN105273020
【申请号】CN201510657121
【发明人】曾晓雄, 唐骥龙, 闫亚美
【申请人】南京农业大学
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年10月10日