使用纳米粒子辅助信号放大的rna微芯片检测的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请案的夺叉参考
[0002] 本申请案要求2013年4月4日递交的第61/808,447号美国临时申请案的权益。 2013年4月4日递交的第61/808, 447号申请案在此以全文引用的方式并入本文中。
[0003] 序列表的参考
[0004]依据37C.F.R. § 1. 52(e) (5)，以命名为"GSURF_2013_17_PCT_Sequence_ Listing,txt"、于2014年4月4日创建并且大小为4, 889字节的文本文件形式在2014年 4月4日提交的序列表在此以引用的方式并入。
技术领域
[0005] 所公开的发明一般在核酸检测和分析领域中并且尤其在RNA检测和分析领域中。
【背景技术】
[0006] 自然大流行病（例如，西尼罗病毒（WNV)和流感大流行病）（普里普佐娃 (Pripuzova)等人，公共科学图书馆?综合（PLoS0ne)，7，e43246(2012);惠勒（Wheeler) 等人，美国热带医学卫生（AmJTropMedHyg) ,87,559 (2012);布劳特（Brault)，医学 昆虫学杂志（JMedEntomol)，49,939(2012);科萨瓦拉珠（Kesavaraju)等人，美国热 带医学卫生，87, 359 (2012))食物中毒爆发（如大肠杆菌（Escherichiacoli) 0157 :H7) 是对人类健康和生命的致命威胁。在护理点快速并且精确检测这些人类病原体为恰当医 学治疗和挽救生命所必需。用于传染病快速诊断的病毒和细菌病原体检测是主要医疗挑 战。举例来说，需要快速检测出H1N1流感、WNV、炭疽芽胞杆菌（bacillusanthracis)和 病原性大肠杆菌以使爆发范围和爆发的致命影响减到最小。基于培养物的方法耗时并且 在获得结论之前通常需要2-3天（马彻（March)和拉特曼（Ratnam)，临床微生物学杂 志（JClinMicrobiol), 23, 869(1986))。基于抗原-抗体的免疫分析（S卩，ELISA)无 法有效地区别不同病毒株之间的细微差异，虽然其是快速并且稳健的。另一方面，基于核 酸的检测方法，如实时聚合酶链反应（PCR)和cDNA阵列（巴斯汀（Bustin)，分子内分 泌学杂志（JMolEndocrinol) ,25, 169 (2000);卡尔（Call),微生物学评论（CritRev Microbiol) ,31，91 (2005);沃拉（Vora)等人，分子和细胞探针（Molecularandcellular probes)，22, 294(2008))可以检测单核苷酸差异并且提供较高检测特异性。然而，其未能 直接检测RNA，并且需要逆转录（RT)和多个步骤。PCR扩增可能产生归因于缺乏严格的污 染控制的假阳性结果。已研发出用于DNA检测的许多其它策略，如基于核酸序列的扩增 (赵（Zhao)等人，临床微生物学杂志，47, 2067(2009))、质谱分析（李（Li)等人，分析化 学（AnalChem), 82, 3399 (2010))以及滚环扩增（穆拉卡米（Murakami)等人，核酸研究 (NucleicAcidsRes), 40,e22(2012))。
[0007]此外，直接RNA检测的现用方法，如诺瑟印迹（Northernblot)、RNA酶 保护分析、微RNA谱分析以及直接RNA测序（纳尔逊（Nelson)等人，自然方法 (NatMethods)，1，155 (2004);桑德林（Sandelin)等人，基因株自然评论（NatRev Genet), 8, 424 (2007);奥索拉克（Ozsolak)，自然（Nature) ,461,814 (2009))是劳动密集型 的、耗时、成本高的和/或仪器密集型的。这些途径并不非常适合于快速和精确RNA检测， 尤其是护理点诊断和现场应用。最近，已展示基于表面等离子共振（SPR)的多重RNA生物 传感器（方（Fang)等人，美国化学会志（JAmChemSoc)，128, 14044(2006);李等人，朗缪 尔（Langmuir)，22, 5241 (2006))和基于锁核酸（LNA)的微RNA微阵列以及Au-纳米粒子缀 合物（卡斯托蒂化38切1虹）等人，1^^，12,913(2006))。然而，1^^样品制备和适宜检测仍 是复杂并且耗时的，其是用于护理点病原体和疾病诊断的直接RNA检测方面的主要挑战。
[0008] 本发明的一个目标是提供用于在不需要核酸扩增的情况下快速并且灵敏检测RNA 的方法和组合物。
[0009] 本发明的另一个目标是提供用于在不需要昂贵和/或操作复杂的设备的情况下 容易检测RNA的方法和组合物。
[0010] 本发明的另一个目标是提供用于检测病原体的方法和组合物。
【发明内容】
[0011] 公开用于检测样品中的RNA的方法和材料。在一些形式中，所述方法涉及（a)使所 述样品和探针阵列接触，（b)使所述探针阵列和对RNA/DNA杂交体具有特异性的核糖核酸 酶（如RNA酶H)接触，（c)使所述探针阵列、标记核苷酸以及能够使用DNA模板延伸RNA链 并且能够在来自RNA链的延伸物中并入所述标记核苷酸的核酸聚合酶（如克列诺片段DNA 聚合酶）接触，以及（d)检测延伸核酸链中的所述标记核苷酸。所述探针阵列包含一个或 多个嵌合探针。所述嵌合探针包含DNA区域和RNA区域，其中所述DNA区域和所述RNA区 域相邻，并且其中所述DNA区域是所述RNA区域的5'。所述嵌合探针还可以包括第二DNA 区域。所述第二DNA区域还可以与所述RNA区域相邻并且可以是所述RNA区域的3'。如果 样品含有与嵌合探针中的至少一个的核苷酸序列互补的RNA分子，那么RNA分子将与互补 嵌合探针杂交。在一些形式中，使样品和探针阵列接触，使探针阵列和核糖核酸酶接触，并 且使探针阵列、标记核苷酸以及核酸聚合酶接触（步骤（a)、（b)以及（c))同时进行。
[0012] 在所述方法中，所述样品中的RNA分子可以与具有互补序列的嵌合探针杂交。与 嵌合探针的DNA区域杂交的RNA分子的部分被对RNA/DNA杂交体具有特异性的核糖核酸酶 降解。杂交RNA分子可以接着延伸形成延伸核酸链，其中嵌合探针的DNA区域用作模板。将 至少一种标记核苷酸并入延伸核酸链中以用于标记。标记核苷酸包含第一标记。由于嵌合 探针和与嵌合探针杂交的RNA分子之间的序列关系，延伸核酸链中的标记核苷酸的检测表 不样品中存在RNA分子。
[0013] 在方法的一些形式中，标记和检测可以通过标记第一标记来增强。这可以例如通 过使探针阵列和标记缀合物接触来实现，其中标记缀合物包含特异性结合分子和第二标 记，并且其中所述特异性结合分子与第一标记结合。接着通过检测第二标记来检测延伸核 酸链中的标记核苷酸。第一标记与标记缀合物的适用组合的一个实例是以生物素作为第一 标记和以抗生蛋白链菌素缀合金纳米粒子作为标记缀合物。在这个实例中，抗生蛋白链菌 素是与第一标记（生物素）结合的特异性结合分子，并且金纳米粒子是第二标记。
[0014] 通过使用可以聚集在第二标记位点上或位点处的另一种缀合物，提高位点处的第 二标记的量，提高检测灵敏度并且使检测更容易。这可以例如通过使探针阵列和检测缀合 物接触来实现，其中检测缀合物包含聚集体，并且其中聚集体介导标记缀合物上检测缀合 物的聚集。第二标记与检测缀合物的适用组合的一个实例是作为第二标记的金纳米粒子和 作为检测缀合物的银纳米粒子。在这个实例中，银纳米粒子是聚集体。银纳米粒子与金纳 米粒子反应以在金纳米粒子的位点处积聚银纳米粒子。反应的银纳米粒子的积聚可以有足 够量以用肉眼检测到。
[0015] 在护理点处快速并且精确检测如RNA病毒的病原体将允许恰当治疗患者并且挽 救生命。所公开的RNA微芯片可以在无逆转录和PCR扩增的情况下直接检测RNA。所公开 的RNA微芯片可以使用纳米粒子辅助信号放大。所公开的RNA微芯片技术是简单并且精确 的，并且可以区别单一核苷酸差异。在一些形式中，可以在1小时内灵敏地检测RNA，并且可 以通过肉眼检测到信号。视觉读出格式和简单性使得所公开的RNA微芯片技术较适用于在 诊所和具有最少资源的现场快速并且精确检测病原体。
[0016] 所公开的技术还可以用于检测并且分析来自单个或多个来源的任何RNA或RNA组 合。举例来说，所述技术可以用于检测细胞和样品中的RNA表达谱。作为另一个实例，探针 阵列可以包括一个或多个与例如病毒、细菌或微生物特有的核苷酸序列互补的嵌合探针。 特有的核苷酸序列的检测表示存在对应病毒、细菌或微生物。
[0017]可以通过使用嵌合探针固定到上面作为探针阵列的固态基质来帮助所公开的方 法。特定嵌合探针的位置允许鉴别所检测的RNA分子，因为标记所检测到的位置处的嵌合 探针的序列是已知的。通过在探针阵列上包括多个不同嵌合探针，可以检测多个不同RNA 分子。可以通过在探针阵列上的相同位置处分组对不同RNA分子具有特异性的不同嵌合探 针来共同地检测相关RNA分子。这可以简化例如具有可变序列的靶标的检测。
[0018] 在一些形式中，所述嵌合探针可以经稳定。如嵌合探针的经稳定的核酸可以例如 使用抵抗降解的核酸的修饰核苷酸。适用的修饰核苷酸的实例包括2'-0-甲基核苷酸。在 一些形式中，嵌合探针还可以包括3'-连接基团以促进或介导嵌合探针的固定。举例来说， 3'_连接基团可以是氨基。
[0019] 还公开了探针阵列。适用于公开方法的探针阵列可以包含一个或多个所公开的嵌 合探针。还公开了试剂盒。适用于所公开的方法的试剂盒可以包含探针阵列、标记核苷酸 以及标记缀合物，全部都如本文中所公开。所述试剂盒还可以和/或替代地包括对RNA/DNA 杂交体具有特异性的核糖核酸酶（如RNA酶H)、能够使用DNA模板延伸RNA链并且能够在 来自RNA链的延伸物中并入标记核苷酸的核酸聚合酶（如克列诺片段DNA聚合酶）或两种。
[0020] 所公开的方法和组合物的额外优势将部分阐述在其后描述中，并且部分将从所述 描述理解，或可以由所公开的方法和组合物的实践习得。所公开的方法和组合物的优势将 借助于尤其在所附权利要求书中指出的要素和组合来实现和获得。应理解，前文大体描述 以及以下详细描述仅是示例性以及解释性的并且并不限制所要求的发明。
【附图说明】
[0021] 并入本说明书中并且构成其一部分的【附图说明】了所公开的方法和组合物的若干 实施例，并且与说明书一起用来解释所公开的方法和组合物的原理。
[0022] 图1显示所公开的RNA微芯片和使用纳米粒子辅助信号放大的RNA视觉检测的实 例。显示RNA快速并且直接的检测的流程图。RNA探针与靶RNA杂交，继而RNA酶Η消化并 且克列诺延伸并且并入生物素标记的dNTP。抗生蛋白链菌素缀合Au-NP与生物素结合并且 接着将生物素标记转换成Au-NP标记。Au-NP催化Ag-NP形成和聚集以便用肉眼进行视觉 检测（或借助于放大镜）。
[0023] 图2A显示在微芯片上利用单一核苷酸辨别的RNA直接检测。按顺序从上到下序 列是SEQIDN0:10、SEQIDN0:11、SEQIDN0:12、SEQIDN0:13、SEQIDN0:14、SEQID NO: 10 的核苷酸 1-13、SEQIDNO: 11、SEQIDNO: 15 以及SEQIDNO: 11。信号光点的尺寸 大约是75微米，其是肉眼可见的（或借助于放大镜）。这一和其它RNA微芯片上的所有信 号光点的尺寸类似。
[0024] 图2B、2C、2D、2E以及2F显示RNA微芯片和RNA视觉检测。（B)在生物素化dNTP 不存在下的RNA检测（阴性对照）。（C)不存在RNA(阴性对照）。（D)使用天然dNTP(阴性 对照）。（E)在RNA和生物素化dNTP存在下的RNA检测。（F)利用单一核苷酸辨别的RNA 检测。信号光点（大约75微米）是肉眼可见的。这一和其它RNA微芯片上的所有信号光 点的尺寸类似。
[0025] 图3A、3B、3C、3D、3E以及3F显示利用所公开的RNA微芯片的一个实例的特异性和 个别mRNA检测。RNA微芯片用RNA探针固定。BF、AF、LacZ以及BA探针分别检测鸟流感 (BF)RNA、禽流感（AF)RNA、LacZRNA以及炭疽芽胞杆菌（BA)RNA。通过将生物素标记的dNTP 特异性并入靶RNA中来检测靶RNA。（A)样品含有BARNA。（B)样品含有LacZ和BARNA。 (C)样品含有BF、AF以及LacZRNA。⑶样品含有所有RNA。（E)总RNA中的个别RNA(LacZ mRNA)的检测。芯片I:水（无RNA;阴性对照）；芯片II:从IPTG诱导的大肠杆菌中分离 的总RNA(含有LacZ);芯片III:从葡萄糖抑制的大肠杆菌中分离的总RNA(不含有LacZ)。 (F)经由NaOH直接处理大肠杆菌的简单RNA样品制备检测个别RNA(LacZmRNA)。芯片I: 水（无RNA;阴性对照）；芯片II和III:分别是经NaOH处理的用IPTG诱导的大肠杆菌以 及葡萄糖抑制的大肠杆菌。
[0026] 图4显示作为探针固定的一个实例的玻璃微芯片表面的活化。表面化学反应实现 胺修饰嵌合探针的固定。
[0027] 图5A、5B、5CjD以及5E显示利用所公开的RNA微芯片的一个实例的灵敏并且快 速的RNA检测。㈧灵敏检测。芯片1-5分别含有0、5、15和50飞摩尔的LacZRNA。（B)经 由合并RNA酶Η和克列诺步骤的RNA检测。（C)经由合并杂交、RNA酶Η和克列诺步骤（15 分钟培育用于组合的步骤）的RNA检测。（D)快速RNA检测（45分钟内，包括RNA样品制 备）。生物素化寡核苷酸-35. 2 (阳性对照）；ΒΑ探针（阴性对照）未检测到大肠杆菌RNA。 (Ε)在用70%乙醇处理IPTG诱导细胞0、30、45和60分钟之后大肠杆菌RNA(LacZRNA)的 检测。葡萄糖抑制的大肠杆菌细胞（Glu)用作阴性对照。
【具体实施方式】
[0028] 参考特定实施例和其中所包括的实例的以下详细描述以及图和其先前和以下描 述，可以更容易理解所公开的方法和组合物。
[0029] 微阵列技术呈现用于分析细胞群体的特异性mRNA的有力工具。DNA微阵列的效用 受其RNA非直接分析限制，所述RNA非直接分析增加了处理时间以及多个偏差和人为因素。 RNA的直接检测仍是个挑战，因为RNA易于降解，并且标记RNA混合物中的特异性RNA是困 难的。公开了用于例如病原体和病毒RNA检测的直接、快速、特异性、易于使用、经济并且灵 敏的微芯片。通过使用核酸酶、聚合酶以及纳米材料，可以在无逆转录的情况下检测特异性 RNA。在所述方法的多靶标形式中，检测方法是特异性的并且可以在小于一小时内实现。所 公开的技术可以用于检测并且分析多种领域，包括例如传染病诊断、食品安全、基因表达谱 分析以及癌症检测方面的特异性mRNA。
[0030] 在一些形式中，所公开的RNA检测系统是简单的：在靶RNA与用RNA 探针固定的RNA微芯片杂交之后（斯潘塞（Spencer)等人，化学生物化学 (ChemBioChem)，11，1378(2010))，结合的RNA用RNA酶Η消化并且通过克列诺DNA聚合 酶用生物素标记的dNTP延伸。使用抗生蛋白链菌素与金纳米粒子的缀合物（Au-NP)，接 着将并入靶RNA中的生物素标记转换成Au-NP标记。Au-NP可以经由银染色催化形成银 纳米粒子（Ag-NP)(塔东（Taton)，科学（Science)，289，1757(2000);曹（Cao)等人，生 物传感器和生物电子学（BiosensBioelectron) ,22, 393 (2006):齐（Qi)等人，分析和 生物分析化学（AnalBioanalChem) ,398,2745 (2010);唐（Tang)等人，诊断微生物学 与传染病（DiagnMicrobiolInfectDis), 65, 372 (2009);周（Zhou)等人，美国化学会 志，132, 6932(2010))，允许信号放大高达100倍。所形成的Ag-NP(图1和2)聚集并且 沉积为RNA探针位点上的暗点。最后，将形成大量这些暗点的图像以便直接视觉观测。此 外，我们发现，这一RNA微芯片可以在较低飞摩尔水平下区别单一核苷酸差异并且检测 RNA。RNA检测系统是基于我们的RNA3' -标记途径，其中DNA聚合酶直接将标记的dNTP 并入DNA模板上的RNA(黄（Huang)和阿塞蒂（Alsaidi),分析生物化学（Analytical Biochemistry) ,322,269 (2003);阿塞蒂等人，化学生物化学，5, 1136 (2004))。为了直接 检测RNA，我们设计了官能化RNA作为RNA探针。RNA探针由RNA3' -区域和DNA5' -区域 组成（图1和2)。
[0031] 公开用于检测样品中的RNA的方法和材料。在一些形式中，所述方法涉及（a)使所 述样品和探针阵列接触，（b)使所述探针阵列和对RNA/DNA杂交体具有特异性的核糖核酸 酶（如RNA酶H)接触，（c)使所述探针阵列、标记核苷酸以及能够使用DNA模板延伸RNA链 并且能够在来自RNA链的延伸物中并入所述标记核苷酸的核酸聚合酶（如克列诺片段DNA 聚合酶）接触，以及（d)检测延伸核酸链中的所述标记核苷酸。所述探针阵列包含一个或 多个嵌合探针。所述嵌合探针包含DNA区域和RNA区域，其中所述DNA区域和所述RNA区 域相邻，并且其中所述DNA区域是所述RNA区域的5'。如果样品含有与嵌合探针中的至少 一个的核苷酸序列互补的RNA分子，那么RNA分子将与互补嵌合探针杂交。在一些形式中， 嵌合探针还可以包括3'-连接基团以促进或介导嵌合探针的固定。举例来说，3'-连接基团 可以是氨基。
[0032] 应理解，除非另外规定，否则所公开的方法和组合物不限于特定合成方法、特定分 析技术或特定试剂，并且因而可以改变。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施 例的目的，并且并不意图作为限制。
[0033] 材料
[0034] 公开了可以用于所公开的方法和组合物、可以与其结合使用、可以用于制备其或 是其产物的材料、组合物以及组分。本文公开了这些和其它材料，并且应理解，当公开这些 材料的组合、子集、相互作用、基团等时，虽然可能未明确公开各个不同个体和集体组合和 这些化合物的排列的特定参考，但在本文中尤其涵盖并且描述各者。举例来说，如果公开并 且论述了嵌合探针并且论述了可以对包括嵌合探针的多种分子作出的多种修饰，那么除非 特定相反说明，否则尤其涵盖嵌合探针和可能修饰的每一个组合和排列。因此，如果公开一 类分子A、B和C以及一类分子D、E和F，并且公开组合分子A-D的一个实例，那么即使未单 独地叙述各者，也单独地和共同地涵盖各者。因此，在这个实例中，尤其涵盖每个组合A-E、 A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E以及C-F并且应将其视为从A、B和C;D、E和F以及示例性组 合A-D的公开内容公开。同样地，还尤其涵盖并且公开这些的任何子集或组合。因此，举例 来说，尤其涵盖A-E、B-F和C-E的子群并且应将其视为从A、B和C;D、E和F以及示例性组 合A-D的公开内容公开。此外，如上文所涵盖和公开的材料、组合物、组分等中的每一个还 可以特定地并且独立地包括此类材料的任何群组、子组、清单、集合等或从其中排除。这些 概念适用于本申请案的所有方面，包括（但不限于）制得并且使用所公开的组合物的方法 中的步骤。因此，如果存在多个可以执行的额外步骤，那么应理解，这些额外步骤中的每一 个可以与所公开的方法的任何特定实施例或实施例的组合一起执行，并且特定地涵盖各此 类组合并且应将其视为被公开的。
[0035] A.嵌合探针
[0036] 嵌合探针是可以序列特异性方式与RNA分子杂交的寡核苷酸。嵌合探针包含DNA 区域和RNA区域，其中DNA区域和RNA区域相邻，并且其中DNA区域是RNA区域的5'。在一 些形式中，嵌合探针还可以包括第二DNA区域。在一些形式中，第二DNA区域还可以与RNA 区域相邻并且可以是RNA区域的3'。在所公开的方法中，嵌合探针用于基于RNA