光学纯7-氨基-2,3,4,5-四氢苯并[b][1,4]氧氮杂卓-3-醇及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及7-氨基-2, 3, 4, 5-四氨苯并比][1，4]氧氮杂卓-3-醇及其应用，尤 其设及光学纯（R-型和S-型）7-氨基-2, 3, 4, 5-四氨苯并比][1，4]氧氮杂卓-3-醇及其 在抑制细菌憐脂酷胆碱特异性的憐脂酶C(PC-PLC)中的应用。
【背景技术】
[0002] PC-PLC，即憐脂酷胆碱特异性的憐脂酶C，是憐脂酶家族的重要成员之一，能够特 异性水解甘油憐脂分子的第3位憐酸醋键，释放憐酸胆碱和二酷基甘油。PC-PLC是普遍 存在于各种细胞内的一种重要的酶，其基本生化特性、功能和亚细胞分布等具有细胞特异 性。它通过参与细胞信号转导调节多种细胞的调亡、肿瘤细胞的增殖、转移和分化；另外， PC-PLC不仅是某些细菌在真核细胞之间的传播的重要武器，在免疫细胞的细胞毒性W及病 理炎症反应中也起重要作用。某些细菌的PC-PLC具有致病性，甚至会威胁到人类的生命， 例如由李斯特菌PC-PLC引起的李斯特菌病。李斯特菌病是由单增李斯特菌感染引起的食 源性、致命性疾病，能够通过动物感染人类。细胞内的病原体可W在细胞间进行传播，因此 能够穿过血脑、肠W及胎盘屏障。尤其对于年老者，孕妇和免疫力差的群体来说，李斯特菌 病具有极大的健康危害性。感染了李斯特菌后，会引起一系列严重的疾病，包括败血症，脑 炎，脑膜炎，关节炎，流产，死胎，围产期感染和肠胃炎等等，所W寻找预防和治疗运种疾病 的方法迫在眉睫。然而，有关李斯特菌病的发病机制目前尚不清楚，而PC-PLC作为细菌重 要的毒性因子，在李斯特菌的感染和传播过程中发挥着重要的作用。若从抑制PC-PLC活性 的角度有望能找到解决办法。
[0003] 目前已经报道的PC-PLC特异性抑制剂是D609 (trixyclodecan-g-y^L-xanthogena te)，能专一高效地抑制PC-PLC的活性，因而其成为研究PC-PLC功能的良好工具。但其远 远不能满足科研和临床治疗的需求，因此，研发更多具有抑制PC-PLC活性的化合物或制剂 势在必行。
[0004] 苯并比][1，4]氧氮杂卓衍生物是一类非常重要的结构单元，许多天然产物和合 成药物中都含有该结构单元。例如阿莫沙平（Amoxapine),含有二苯并氧氮杂卓类结构， 具有很强的抗抑郁和精神兴奋作用，抗抑郁谱广，对其他抗抑郁药无效的内源性抑郁病人 也有效。生物体中的核酸、蛋白质、酶W及细胞表面受体是手性的，在生物体系的复杂手性 环境中，手性分子的精确识别导致手性体系产生宏观的物理与化学性质的变化W及生理反 应。当手性药物分子作用于生物体时，通过与体内酶、核酸等大分子中固有的结合位点产生 诱导契合，从而抑制（或激动）该大分子的生理活性，达到治疗的目的，换言之，药物分子 必须与祀分子进行严格地手性识别和匹配才能发生药理作用。不同构型的药物分子产生的 对映相互作用往往不同，甚至截然相反，具有截然不同的药理和毒理作用。虽然一些研究报 道了含有苯并比][1，4]氧氮杂卓结构单元的化合物，但是有关光学纯巧型和S型）7-氨 基-2, 3, 4, 5-四氨苯并比][1，4]氧氮杂卓-3-醇及其在抑制细菌PC-PLC活性中的应用， 目前国内外还没有报道。
【发明内容】
W05] 针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种光学纯（R-型和 S-型）7-氨基-2, 3, 4, 5-四氨苯并比][1，4]氧氮杂卓-3-醇及其在抑制细菌憐脂酷胆碱 特异性的憐脂酶C(PC-PLC)中的应用。
[0006] 本发明所述的光学纯7-氨基-2, 3, 4, 5-四氨苯并比][1，4]氧氮杂卓-3-醇，其 特征在于：所述R-型7-氨基-2, 3, 4, 5-四氨苯并比][1，4]氧氮杂卓-3-醇化合物结构式 如式（I)所示，所述S-型7-氨基-2, 3, 4, 5-四氨苯并比][1，4]氧氮杂卓-3-醇化合物结 构式如式（II)所示，
[0007]
[0008]式（I)
[0009]
[0010] 式（II)。
[0011] 上述的光学纯7-氨基-2, 3, 4, 5-四氨苯并比][1，4]氧氮杂卓-3-醇化合物的制 备方法，步骤是：
[0012] 回流条件下，将光学纯2,4-二硝基苯氧甲基环氧乙烧与酸性介质W摩尔数为1 : (1~9)的比例溶解到极性混合溶剂中，再W2,4-二硝基苯氧甲基环氧乙烧的摩尔数计，加 入其3~6倍量的还原剂；反应混合物继续回流，至TLC检测反应完全；冷却至室溫，W饱 和胞2〇)3溶液调其抑=8,WC盐抽滤，常规方法浓缩掉滤液中的极性溶剂，W乙酸乙醋萃 取；水洗乙酸乙醋相，无水MgS〇4干燥，常规过滤，浓缩，得光学纯7-氨基-2, 3, 4, 5-四氨苯 并比][1，4]氧氮杂卓-3-醇粗品；将上述粗品，W体积比为1 : 3的石油酸/乙酸乙醋或 乙醇作展开剂，经硅胶柱层析分离，得光学纯7-氨基-2, 3, 4, 5-四氨苯并比][1，4]氧氮杂 卓-3-醇纯品。
[0013] 其中：在上述的化合物制备方法中，所述的酸性介质优选是醋酸或氯化锭；所述 的还原剂优选是铁粉或锋粉。
[0014] 在上述的化合物制备方法中：所述的2,4-二硝基苯氧甲基环氧乙烧与酸性介质 及还原剂的摩尔数之比优选为1 : (4~9) : (3~5)。
[0015] 在上述的化合物制备方法中：所述的极性混合溶剂为体积比优选是1:(1~9) 的&0/化OH(水/乙醇）混合溶剂。
[0016] 上述光学纯7-氨基-2, 3, 4, 5-四氨苯并比][1，4]氧氮杂卓-3-醇化合物制备反 应式如下：
[0017]
[0018] 本发明所述光学纯7-氨基-2, 3, 4, 5-四氨苯并比][1，4]氧氮杂卓-3-醇在抑制 细菌憐脂酷胆碱特异性的憐脂酶C(PC-PLC)活性中的应用。
[0019] 其中：所述R-型7-氨基-2, 3, 4, 5-四氨苯并比][1，4]氧氮杂卓-3-醇能有效抑 制细菌PC-PLC活性的剂量优选为5~10yM。
[0020] 其中：所述S-型7-氨基-2, 3, 4, 5-四氨苯并比][1，4]氧氮杂卓-3-醇能有效抑 制细菌PC-PLC活性的剂量优选为5~10yM。
[0021] 为了更好地理解本发明的实质，下面结合R型和S型7-氨基-2, 3, 4, 5-四氨苯并 比][1，4]氧氮杂卓-3-醇的细胞生物学实验及结果来阐明其在抑制细菌PC-PLC活性中的 新用途。
[0022] 1.R型和S型7-氨基-2, 3, 4, 5-四氨苯并比][1，4]氧氮杂卓-3-醇对细菌PC-PLC 活性的影响 阳02引实验组：分别将浓度为5yM，10yM，20yM的R型和S型7-氨基-2, 3, 4, 5-四氨 苯并比][1，4]氧氮杂卓-3-醇^及0609(浓度为5，10,20^1)与0.01抓(0.1抓/111〇蜡状 芽抱杆菌的PC-PLC混匀并稀释至100祉，37°C解育化，再用AmplexRedPC-PLC-specific assaykit(Mole州IarProbesInc. ,A12218)检测PC-PLC的活性。各个实验组的对照：用 0. 02%DMS0(v/v)代替0.Ol抓(0. 1抓/mL)蜡状芽抱杆菌的PC-PLC。
[0024] 结果表明：与D609运一实验组相比，5yM的R型和S型7-氨基-2, 3, 4, 5-四氨 苯并比][1，4]氧氮杂卓-3-醇处理组就能够明显抑制蜡状芽抱杆菌的PC-PLC活性，而相 同浓度下D609不起作用（见附图1)，由此可W看出R型和S型7-氨基-2, 3, 4, 5-四氨苯 并比][1，4]氧氮杂卓-3-醇在抑制细菌PC-PLC活性方面更具优势。
[00巧]2.R型和S型7-氨基-2, 3, 4, 5-四氨苯并比][1，4]氧氮杂卓-3-醇对蜡状芽抱 杆菌的PC-PLC活性影响的时间依赖性
[0026]实验组：分别将浓度为SiiM的R型和S型7-氨基-2,3, 4,5-四氨苯并比] [1，4]氧氮杂卓-3-醇与0.Ol抓(0. 1抓/mL)蜡状芽抱杆菌的PC-PLC混匀并稀释至IOOuL 37°C解育 1.5,3,6h，再用Amplex Red PC-PLC-specific assay kit(Molecular Probes Inc.，A12218)检测PC-PLC的活性。对照组：用 0. 02%DMSO(v/v)代替 0.Ol抓(0.I抓/mL) 蜡状芽抱杆菌的PC-PLC。
[0027]结果表明：与对照相比，浓度为5iiM的R型和S型7-氨基-2, 3, 4, 5-四氨苯并 比][1，4]氧氮杂卓-3-醇处理组在化和化均能够有效抑制蜡状芽抱杆菌PC-PLC的活性 (见附图2)。
[002引由上述实验及其结果，可W得出如下结论：
[0029]R型和S型7-氨基-2, 3, 4, 5-四氨苯并比][1，4]氧氮杂卓-3-醇具有显著抑制蜡 状芽抱杆菌PC-PLC的活性的作用，此结果对将来用于制备治疗由细菌PC-PLC导致的人类 疾病药物研究和开发奠定了理论基础。进一步的实验研究表明，一定浓度下巧，10, 20iiM) 的R型和S型7-氨基-2, 3, 4, 5-四氨苯并比][1，4]氧氮杂卓-3-醇与蜡状芽抱杆菌PC-PLC 混合，37°C下解育1. 5, 3W及化后，其抑制细菌PC-PLC活性的效果已比较明显。运一发现 为将来进一步研制开发治疗李斯特菌病W及由其他细菌PC-PLC导致的人类疾病的药物提 供了支持，也为R型和S型7-氨基-2, 3, 4, 5-四氨苯并比][1，4]氧氮杂卓-3-醇作为一 种有效的工具，用于抑制细菌的PC-PLC活性研究及研制和开发有关由细菌PC-PLC导致的 人类疾病治疗药物奠定了基础。
【附图说明】
[0030] 图1，R型和S型7-氨基-2, 3, 4, 5-四氨苯并比][1，4]氧氮杂卓-3-醇有效地抑 制细菌PC-PLC活性。
[0031]其中：
[0032]A:用AmplexRedPC-PLC-specificassaykit(MolecularProbesInc. ,A12218) 检测D609巧，10,20yM)对0.Ol抓(0.I抓/mL)蜡状芽抱杆菌PC-PLC活性的影响（3h)。 阳03；3]B:用同样的方法，检测R型7-氨基-2, 3, 4, 5-四氨苯并比][1，"氧氮杂卓-3-醇 巧，10, 20yM)对0.Ol抓(0. 1抓/mL)蜡状芽抱杆菌PC-PLC活性的影响（3h)。
[0034]C:用同样的方法，检测S型7-氨基-2, 3, 4, 5-四氨苯并比][1，4]氧氮杂卓-3-醇 巧，10, 20yM)对0.Ol抓(0. 1抓/mL)蜡状芽抱杆菌PC-PLC活性的影响（3h)。
[0035] 图2,R型和S型