一种新来源亚硝酸降解低分子肝素的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种新来源亚硝酸降解低分子肝素的制备方法，特别设及一种利用牛 来源（牛肺、牛肠）和羊来源（羊肠）肝素通过亚硝酸降解制备低分子肝素的方法，属于原 料药制备技术领域。
【背景技术】
[0002] 肝素属于一种抗凝血临床药物，可从各种哺乳动物的粘膜组织提取，1916年首先 发现于狗的肝脏中，后来为得到高产量又将来源主要转向牛和猪。但由于上世纪末欧洲爆 发的"疯牛病"和"羊痊痒病"由牛与羊传染给人类而致死，进而牛和羊来源肝素被禁用，导 致目前肝素类药物原料仅限于猪来源。低分子肝素主要经肝素降解制备而成，具有比肝素 生物活性更高，半衰期更长和副作用更少的临床治疗优势，属于一种高效抗血栓药物，而且 每年有超过60%的肝素用于制备低分子肝素。目前欧洲药典收录至少五种低分子肝素，但 运些低分子肝素均限制为猪来源肝素为原料制备，运样形成了低分子肝素原料来源单一的 产业链。运种原料来源单一的市场结构已潜在地威胁肝素类药物市场的稳定。目前"疯牛 病"和"羊痊痒病"已得到有效控制，其来源的肝素经现有的各种纯化技术可保证安全。
[0003] 根据联合国粮农组织数据显示全球范围内牛和羊的饲养量一直高于猪的饲养量， 而猪来源肝素也将无法满足目前老龄化时代的医疗需求。牛和羊将被发展为低分子肝素类 药物新的物种来源已是必然。
【发明内容】
[0004] 本发明针对亚硝酸降解类低分子肝素药物物种来源单一性的问题，利用新物种来 源的肝素通过亚硝酸降解制备低分子肝素。 阳00引发明概述
[0006] 本发明利用从牛、羊体内提取的肝素经亚硝酸降解方法制备两类低分子肝素：那 曲肝素巧与达肝素钢，并通过分别与EP标准品进行结构与抗凝活性的比较，从而初步确定 W上低分子肝素类药物的临床应用价值。
[0007] 发明详述
[0008] 本发明技术方案如下：
[0009] 那曲肝素巧的制备方法，步骤如下：
[0010] (i)将由原料牛肺、牛肠和/或羊肠制备的肝素钢完全溶解于水中，加入亚硝酸 钢，肝素钢为亚硝酸钢质量的10~30倍，调抑为2~5,反应80~120分钟，然后调抑至 9~12,制得反应液A;
[0011] (ii)向步骤（i)制得的反应液A中，加入棚氨化钢，棚氨化钢为肝素钢质量的1~ 3%，反应4~8小时，盐酸调抑至2~5,混合均匀，再用氨氧化钢调至中性，制得反应液 B；
[0012] (iii)向步骤（ii)制得的反应液B中，加入3~5倍体积的醇，固液分离，干燥，制 得固体A,然后将固体A溶于水中，固体A与水的质量体积比为I:巧~10)，单位g/mL，审。 得反应液C;
[0013] (iv)将步骤（iii)制得的反应液C，通过阳离子交换树脂将钢离子置换为巧离子， 制得反应液D;
[0014] (V)向步骤（iv)制得的反应液D中加入3~5倍体积的醇，充分混合后，固液分 离，经纯化，干燥，制得低分子肝素。
[0015] 根据本发明优选的，所述步骤（i)中，调抑的酸性抑调节剂为盐酸，碱性抑调节 剂为氨氧化钢。
[0016] 根据本发明优选的，所述步骤（iii)、（V)中的醇为甲醇或乙醇。
[0017] 根据本发明优选的，所述步骤（iii)、（V)中，固液分离为过滤或离屯、。
[0018] 根据本发明优选的，所述步骤（V)中的纯化为透析膜透析或醇沉；根据本发明优 选的，所述步骤（V)中，干燥为-50~-60°C冻干。
[0019] 达肝素钢的制备方法，步骤如下：
[0020] (1)将由原料牛肺、牛肠和/或羊肠制备的肝素钢完全溶解于水中，加入亚硝酸 钢，肝素钢为亚硝酸钢质量的30~60倍，调抑为2~5,反应50~120分钟，然后调抑至 9~12,制得反应液a;
[OOW似向步骤（1)制得的反应液a中，加入棚氨化钢，棚氨化钢为肝素钢质量的1~ 2%，反应6~12小时，氨氧化钢调至中性，制得反应液b; 阳02引 做向步骤似制得的反应液b中，加入3~5倍体积的醇，固液分离，干燥，制得 固体a,然后将固体a溶于水中，固体a与水的质量体积比为1 :巧~10)，单位g/mL，制得 反应液C;
[002引 （4)将步骤做制得的反应液C，加入体积百分比为0. 8~1. 5%的双氧水，经25~ 30°C氧化10~20小时，制得反应液d;
[0024] 妨向步骤（4)制得的反应液d中加入3~5倍体积的醇，充分混合后，固液分离， 经纯化，干燥，制得低分子肝素。
[0025] 根据本发明优选的，所述步骤（1)中，调抑的酸性抑调节剂为盐酸，碱性抑调节 剂为氨氧化钢。
[00%] 根据本发明优选的，所述步骤（3)、巧）的醇溶液为甲醇或乙醇。
[0027]根据本发明优选的，所述步骤（3)、巧）中，固液分离为过滤或离屯、。
[0028] 根据本发明优选的，所述步骤巧）中的纯化选择透析膜分别为分子量截留值3000 和8000的超滤膜进行超滤纯化。
[0029] 根据本发明优选的，所述步骤巧）中，干燥为-50~-60°C冻干。
[0030] 有益效果
[0031] 1、本发明利用新物种来源肝素通过亚硝酸降解法制备低分子肝素，通过分析新物 种来源的低分子肝素与市场上低分子肝素的结构与活性差异初步确定牛、羊来源低分子肝 素的临床药用价值。本发明可W从根本上促进低分子肝素的物种来源多样化，拓展肝素类 药物原料的供应，达到更高程度地稳定肝素类与低分子肝素类药物市场的目的。
[0032]2、本发明采用牛肺、牛肠和/或羊肠作为原料能够制备分子量更小的低分子肝 素，因而生物活性更高。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步描述，但本发明所保护范围不限于 此。
[0034] 实施例和对比例中所述的原料牛肺，牛肠，羊肠制备的肝素钢按现有技术纯化制 备，可参见王庆元的《肝素钢工艺研究》（《中国医药工业杂志》1991年05期）中描述方法， 制得肝素钢。 阳0对 实施例1
[0036] 牛肺来源肝素钢制备那曲肝素巧样品，步骤如下：
[0037] a)将牛肺来源肝素钢完全溶解于水中，加入亚硝酸钢，肝素钢为亚硝酸钢质量的 30倍，调抑为2. 5,反应80分钟，然后调抑至10,制得反应液A;
[00測 扣）向步骤a)制得的反应液A中，加入棚氨化钢，棚氨化钢与肝素钢的质量百分 比为1 %，反应6小时，盐酸调抑至3,混合均匀，再用氨氧化钢调至中性，制得反应液B;
[0039] (iii)向步骤（ii)制得的反应液B中，加入4倍体积的乙醇，固液分离，干燥，制得 固体A，然后将固体A溶于水中，固体A与水的质量体积比为1 :10,单位g/mL，制得反应液 C； W40] (iv)将步骤（iii)制得的反应液C，通过阳离子交换树脂将钢盐样品置换为巧盐 样品并保留收集液，制得反应液D;
[OOW(V)向步骤（iv)制得的反应液D中加入5倍体积的乙醇，充分混合后，固液分离， 将醇沉样品用透析膜透析或超滤10分钟或经二次醇沉得那曲肝素巧精品溶液。-60°C冻 干，制得牛肺那曲肝素巧。 柳42] 实施例2
[0043] 牛肠来源肝素钢制备那曲肝素巧样品，步骤如下：
[0044] (i)将牛肠来源肝素钢完全溶解于水中，加入亚硝酸钢，肝素钢为亚硝酸钢质量的 15倍，调抑为3,反应110分钟，然后调抑至10,制得反应液A;
[0045] (ii)向步骤（i)制得的反应液A中，加入棚氨化钢，棚氨化钢与肝素钢的质量百分 比为3%，反应4小时，盐酸调抑至3,混合均匀，再用氨氧化钢调至中性，制得反应液B;
[0046] (iii)向步骤（ii)制得的反应液B中，加入4倍体积的乙醇，固液分离，干燥，审U 得固体A，然后将固体A溶于水中，固体A与水的质量体积比为1 :8,单位g/mL，制得反应液 C；
[0047] (iv)将步骤（iii)制得的反应液C，通过阳离子交换树脂将钢盐样品置换为巧盐 样品并保留收集液，制得反应液D; W48] (V)向步骤（iv)制得的反应液D中加入3倍体积的乙醇，充分混合后，固液分离， 将醇沉样品用透析膜透析或超滤10分钟或经二次醇沉得那曲肝素巧精品溶液。-60°C冻 干，制得牛肠那曲肝素巧。 W49] 实施例3
[0050] 羊肠来源肝素钢制备那曲肝素巧样品，步骤如下：
[0051] (i)将羊肠来源肝素钢完全溶解于水中，加入亚硝酸钢，肝素钢为亚硝酸钢质量的 10倍，调抑为4,反应100分钟，然后调抑至10,制得反应液A;
[0052] (ii)向步骤（i)制得的反应液A中，加入棚氨化钢，棚氨化钢与肝素钢的质量百分 比为2%，反应5小时，盐酸调抑至4,混合均匀，再用氨氧化钢调至中性，制得反应液B;
[0053] (iii)向步骤（ii)制得的反应液B中，加入3倍体积的乙醇，固液分离，干燥，审U 得固体A，然后将固体A溶于水中，固体A与水的质量体积比为1 :6,单位g/mL，制得反应液 C；
[0054] (iv)将步骤QiD制得的反应液C，通过阳离子交换树脂将钢盐样品置换为巧盐 样品并保留收集液，制得反应液D;
[(K)对 （V)向步骤（iv)制得的反应液D中加入4倍体积的乙醇，充分混合后，固液分离， 将醇沉样品用透析膜透析或超滤10分钟或经二次醇沉得那曲肝素巧精品溶液。-60°C冻 干，制得羊肠那曲肝素巧。
[0056] 实验例
[0057] 1.分子量分布检测
[0058] 将实施例1-3制备的S种来源那曲肝素巧和那曲肝素巧EP标准品通过GPC方法 与相应软件计算分子量分布并对比。
[0059] 流动相：