一种桑枝抗肿瘤活性多糖rmpw-2的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及了一种多糖的制备方法，尤其是设及了一种桑枝抗肿瘤活性多糖 RMPW-2的制备方法。
【背景技术】
[0002] 多糖（polysaccharide)又称多聚糖，是由单糖聚合而成并且聚合度大于10的极 性复杂大分子，分子量一般为数万甚至数百万。多糖是继蛋白质、核酸之后，又一携带大量 生物信息的生物大分子，来源于真菌、藻类地衣、植物、细菌、动物等。大量的药理和临床研 究表明，天然多糖具有有效的抗癌作用，而且毒副作用较小，展现出广阔的研究和应用前 旦 O
[0003] 桑枝（Ramulusmori)是桑科植物桑（Morusa化a)的干燥枝条，性平味苦，入肝、 脾、肺、肾经，一直是民间常用中药。研究表明，桑枝多糖具有降血糖、免疫调节、抗氧化、抗 肿瘤、抗炎等多种药理活性，但药用机理尚不清楚，运阻碍了桑枝药用水平提高及药用范围 扩大。分离纯化制备桑枝抗肿瘤活性成分，对于推进桑枝药用开发具有积极的现实意义。
【发明内容】
[0004] 为了解决【背景技术】中存在的问题，本发明的目的在于提供一种桑枝抗肿瘤活性多 糖RMPW-2的制备方法，是采用回流提取、DEAE-Se地aroseFastFlow离子交换层析柱分离 和Se地ac巧1S-100、S-300层析柱纯化的方法，制备桑枝抗肿瘤活性多糖RMPW-2。 阳〇化]为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0006] 1)采集桑树春季新生嫩桑枝或春季老桑枝，太阳光下自然晒干，切片，于40°C烘 箱中烘干至恒重，高速粉碎机粉碎后过80-100目筛，得到桑枝粉；
[0007] 2)将桑枝粉经石油酸回流脱脂、经乙醇回流除去巧类和生物碱等小分子物质后获 得桑枝粉残渣；
[0008] 3)将桑枝粉残渣加入双蒸馈水从桑枝中提取出粗多糖；
[0009] 4)将粗多糖用Sevag法除去蛋白质，并用乙醇进行两次沉淀；
[0010] 5)接着依次通过DEAE-Se地aroseFastFlow离子交换层析柱分离洗脱、通过 S巧hacirlS-IOO层析柱除盐洗脱、通过Se地ac巧1S-300层析柱纯化洗脱后，收集第2个 洗脱峰的洗脱液，得到多糖组分RMPW-2。
[0011] 所述步骤2)将桑枝粉进行脱脂、除巧类和生物碱具体为： 阳01引 2. 1)取桑枝粉，按质量体积比（W:V)为1:10加入石油酸溶液，在90°C下回流脱脂Ih后抽滤；
[0013] 2. 2)取残渣用10倍体积质量浓度为80%乙醇在100°C下回流比后抽滤；
[0014] 2. 3)重复上述步骤2. 2) -次，然后取残渣于40°C烘箱中烘干。
[0015] 所述步骤3)加入双蒸馈水从桑枝中提取出粗多糖具体为：
[0016] 3. 1)将烘干桑枝粉残渣按质量体积比（W:V)为1 :10加入双蒸馈水，超声波处理 40min后，于100°C下提取化抽滤，获得残渣和滤液；
[0017] 3. 2)取步骤3. 1)得到的残渣再重复上述步骤3. 1)-次，获得残渣和滤液；
[0018] 3. 3)合并步骤3. 1)和步骤3. 2)得到的滤液，在50°C减压浓缩至原体积的1/3,从 而从桑枝中提取出粗多糖。
[0019] 所述步骤4)将粗多糖用Sevag法除去蛋白质具体为：将粗多糖液用Sevage溶液 反复除蛋白多次直到舰颜色反应和巧=酬反应均检测不到蛋白质，Sevage溶液中氯仿：正 下醇的质量比为4:1，然后于50°C下减压浓缩并除去氯仿和正下醇。
[0020] 所述步骤4)第一次用乙醇进行沉淀具体为：将除去蛋白质的粗多糖液中加入无 水乙醇，边加边揽拌，至乙醇浓度达到80%，置4°C冰箱过夜，800化pm离屯、lOmin，获得第一 次沉淀后的多糖。
[0021] 所述步骤4)第二次用乙醇进行沉淀具体为：将第一次沉淀后的多糖按质量体积 比（W:V)为1:5加入双蒸馈水溶解，加入无水乙醇，边加边揽拌，至乙醇浓度达到60%，置 4°C冰箱过夜，800化pm离屯、lOmin，得到沉淀多糖。
[0022] 所述步骤5)通过DEAE-Se地arose Fast Flow离子交换层析柱洗脱分离具体 为：将沉淀多糖用双蒸馈水溶解配制成20mg/血溶液，800化pm离屯、lOmin，取上清液， 过0. 22Jim滤膜，上DEAE-Se地arose!^istFlow离子交换层析柱用0.IM化Cl液W 3. 0-3. 4mL/min流速洗脱，洗脱时用自动收集器收集，再用苯酪-硫酸法检测收集有显色反 应的洗脱液，40°C下减压浓缩，-50°C下真空冷冻干燥，得到酸性多糖组分，取名为RMPW。
[0023] 所述步骤5)通过Se地ac巧1S-IOO层析柱除盐洗脱具体为：将酸性多糖组分RMPW 用双蒸馈水溶解配制成lOmg/mL溶液，过0. 22Jim滤膜，上Se地ac巧1S-IOO层析柱用双蒸 馈水W0. 5-0. 7mL/min流速洗脱，洗脱时用自动收集器收集，再用苯酪-硫酸法检测收集有 显色反应的洗脱液，40°C下减压浓缩成浓度为IOmg/血。
[0024] 所述步骤5)通过Se地aarlS-300层析柱洗脱纯化具体为：将所述Se地aarl S-IOO层析柱除盐洗脱后得到的浓缩液上Se地ac巧1S-300层析柱用双蒸馈水W 0. 5-0. 7mL/min流速洗脱，洗脱时用自动收集器收集，再用苯酪-硫酸法检测收集第2个 洗脱峰的洗脱液，40°C下减压浓缩，-50°C下真空冷冻干燥，得到均一的多糖组分，取名为 RMPW-2〇 阳0巧]本发明制备得到的多糖组分RMPW-2采用配有TOSOHBIOSEPG4000SW)(L糖类分析 柱的Waters525型高效液相色谱系统，WWaters2410示差折光检测器检测RMPW-2,如图1 所示，呈现单一对称峰，对照标准曲线计算分子量为为5. 06X10化a。 阳0%] 另一方面，采用MlT法检测RMPW-I对人宫颈癌细胞化Ia和人胃癌细胞SGC-7901 的生长均表现出明显的抑制作用（如表1所示），在浓度1. 6mg/血时的抑制率分别为 44. 06 %和32. 57 %，对正常细胞人胚胎肾细胞肥K293和小鼠巨隧细胞RAW264. 7生长均无 不良影响（如表2所示），在浓度1. 6mg/mL时，相对于对照组细胞活力分别为100. 58%和 110. 98%。 W別表1
[0028]
[0031] 所述的减压均通过减压累进行减压。
[0032] 本发明设及的质量体积比的单位均为g:mL。
[0033] 本发明具有的有益效果是：
[0034] 本发明制备的桑枝抗肿瘤活性多糖RMPW-2,纯度均一，分子量为5. 06XIO5Da,对 人宫颈癌细胞化Ia和人胃癌细胞SGC-7901的生长均表现出明显的抑制作用，对正常细胞 人胚胎肾细胞肥K293和小鼠巨隧细胞RAW264. 7生长均无不良影响，可用于抗肿瘤产品的 开发，运对于提升桑枝的药用价值，具有积极的社会效益和经济效益。
【附图说明】
[0035] 图1是RMPW-2纯度检测的凝胶色谱图。
[0036] 表1是RMPW-2对肿瘤细胞生长的影响。
[0037] 表2是RMPW-2正常细胞生长的影响。
【具体实施方式】
[0038] 下面结合附图表和实施例对本发明作进一步说明。
[0039] 本发明W下各个实施例均采用W下方式先获得桑枝原料：
[0040] 实施之前，先将春季新生嫩桑枝或春季老桑枝，太阳光下自然晒干，切片，于40°C 烘箱中烘干至恒重，高速粉碎机粉碎后过80-100目筛，得到桑枝粉；
[0041] 取桑枝粉，按W:V为1:10加入石油酸溶液，在90°C下回流脱脂比，抽滤，残渣用 10倍体积质量浓度为80%乙醇在100°C下回流比，除去巧类和生物碱，重复1次，抽滤，残 渣于4(TC烘干，获得桑枝粉残渣。 阳042] 实施例1 :
[0043] 取过100目筛的春季新生嫩桑枝粉按上述方法脱脂、除巧类和生物碱后获得桑枝 粉残渣，按Ig: 10血料液比加入双蒸馈水，超声波处理40min后，于100°C下提取化再抽滤， 重复1次，合并两次抽滤得到的滤液，在50°C减压浓缩至原体积的1/3,提取出粗多糖；
[0044] 将粗多糖液用Sevage溶液反复除蛋白多次直到舰颜色反应和巧S酬反应均检测 不到蛋白质，Sevage溶液中氯仿：正下醇的质量比为4:1，然后于50°C下减压浓缩并除去 氯仿和正下醇；将除去蛋白质的粗多糖液中加入无水乙醇，边加边揽拌，至乙醇浓度达到 80%，置4°C冰箱过夜，800化pm离屯、lOmin，获得第一次沉淀后的多糖；接着按质量体积比 (W:V)为1:5加入双蒸馈水溶解，加入无水乙醇，边加边揽拌，至乙醇浓度达到60%，置4°C 冰箱过夜，800化pm离屯、lOmin，得到沉淀多糖。 W45] 将沉淀多糖用双蒸馈水溶解配制成20mg/mL溶液，800化pm离屯、lOmin，取上清液， 过0.22ym滤膜，上DEAE-Se地aroseFastFlow离子交换层析柱用0.IM化Cl液^ 3.2血/min流速洗脱，洗脱时用自动收集器收集，再用苯酪-硫酸法检测收集有显色反应的洗脱 液，40°C下减压浓缩，-50°C下真空冷冻干燥，得到酸性多糖组分RMPW。
[0046] 将酸性多糖组分RMPW用双蒸馈水溶解配制成lOmg/mL溶液，过0. 22 y m滤膜，上 S巧hacrylS-IOO层析柱用双蒸馈水W 0. 6血/min流速洗脱，洗脱时用自动收集器收集，再 用苯酪-硫酸法检测收集有显色反应的洗脱液，40°C下减压浓缩成浓度为lOmg/mL。
[0047] 将Se地ac巧1S-IOO层析柱除盐洗脱后得到的浓缩液上Se地ac巧1S-300层析柱 用双蒸馈水W0. 6mL/min流速洗脱，洗脱时用自动收集器收集，再用苯酪-硫酸法检测收 集第2个洗脱峰的洗脱液，40°C下减压浓缩，-50°C下真空冷冻干燥，得到均一的多糖组分 RMPW-2〇 W4引 RMPW-2纯度均一（图1)，分子量5. 06 XIO3Da,在浓度1. 6mg/mL时，对人宫颈癌细 胞化Ia和人胃癌细胞SGC-7901生长的抑制率分别为43. 86%和33. 27%，对正常细胞人胚 胎肾细胞肥K293和小鼠巨隧细胞RAW264. 7生长均无不良影响。 W49] 实施例2 :
[0050] 取过80目筛的春季老桑枝粉按上述方法脱脂、除巧类和生物碱后获得桑枝粉残 渣，按Ig:10血料液比