一种具有增强免疫功能浒苔多糖的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制品技术领域，具体设及一种具有增强免疫功能稱苔多糖的制备 方法及应用。
【背景技术】 阳00引稱苔脑teromonhaprolifera)是一种大型药食兼用的藻类植物，属绿藻口石魏 目石魏科，在全球范围内分布广泛，我国则主要分布于东南沿海地区。该藻生长和繁殖性能 非常强，其生长需要大量的空间，使得海洋中的其它需光藻类生物无法存活，造成大量藻体 死亡；稱苔类植物的死亡可使水体的富营养化，其降解过程能大量消耗氧气，导致水体中溶 氧快速下降，鱼类因缺氧而窒息死亡；水体富营养化还能造成其它藻类植物大量繁殖，影响 沿海的自然景观。因此，稱苔大量增殖将对海洋生态系统造成严重破坏。稱苔多糖的获得 和应用有效地开发了稱苔的药用价值和用途，治理了环境污染，降低了清理成本，提高了社 会和经济效益。
[0003] 经研究发现，稱苔营养丰富，含有多种活性功能成分，药用价值高，开发潜力大。稱 苔多糖是其主要活性成分，具有增强免疫功能生物学活性。由于稱苔多糖结构非常复杂，而 且对于不同提取和纯化分离工艺，所得多糖结构与组分之间也存在很大差异，如何提取纯 化获得具有增强免疫功能的稱苔多糖的制备方法一直是个研究热点问题。
【发明内容】
[0004] 本发明公开了一种具有增强免疫功能稱苔多糖的制备方法及应用，该方法从稱苔 中提取的多糖应用于免疫抑制小鼠可显著改善环憐酷胺诱导的小鼠免疫抑制增强免疫活 性。此制备方法简单、性能稳定、成本低廉、药用价值大，对于促进稱苔资源的综合利用、天 然药物和保健品的研究和开发W及海洋生态保护具有十分重要的意义。 阳〇化]为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
[0006] 一种具有增强免疫功能稱苔多糖的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
[0007] 1)稱苔粗多糖提取：称取稱苔干品，加入20倍水，于90°C提取=次，每次化，纱布 过滤，取浸提液旋转蒸发浓缩到原体积1/6,再加入3倍体积95%乙醇，4°C过夜，得白色絮 状沉淀，冷冻干燥，即为稱苔粗多糖；
[0008] 2)稱苔粗多糖脱蛋白：将稱苔粗多糖溶于蒸馈水，于60°C水浴中加热溶解，冷却 后调整溶液抑值到6. 5,加入木瓜蛋白酶，稱苔粗多糖终浓度为3%，50°C恒溫水浴2.化 后，将溶液于90°C，加热5min，灭活木瓜蛋白酶，冷却至室溫后，加入1/4V的Sevage试剂、 即氯仿：正下醇为4 :1的试剂，反复震荡萃取30min后，300化/min离屯、15min，溶液分层，最 上层是多糖溶液，中间凝胶层即为变性的蛋白质，最下层为有机溶剂，收集最上层溶液，反 复多次萃取，直到没有凝胶层为止，减压浓缩除掉上清液中有机试剂；
[0009] 3)高速离屯、法去除小分子杂质：先用浓氨水调整多糖液抑至8.0,再向其中加入 10%的过氧化氨溶液同时快速揽拌，直至溶液变为淡黄色，50°CW下保溫化脱色素，降至 室溫，将多糖溶液于GOOOr/min离屯、15min，去除小分子杂质；
[0010] 4)氧化法脱去色素：将多糖溶液装入阻滞分子量为3500化的透析袋里，用蒸馈水 透析，化后更换一次透析液，4°C过夜；次日用8000化的聚乙二醇浓缩糖液至1/3体积后， 反复用蒸馈水清洗透析袋表面，收集浓缩的多糖溶液，低溫干燥，得稱苔多糖的粗制品；
[0011] 5)Sephacryl-300凝胶层析柱纯化多糖：将稱苔多糖的粗制品加热溶解于蒸馈水 中，多糖浓度为50mg/mU打开Se地acr^-300层析柱打开水口，待液面几乎于柱床平齐时， 关闭出水口，轻缓加入5mL多糖溶液，防止冲击基质，再次打开开关，待样品刚好与柱床相 平时，关闭阀口，用少量蒸馈水冲洗基质表面及层析柱管壁，打开阀口，待液面于柱床平齐 时，关闭阀口，缓慢加入蒸馈水，充满整个层析柱后，安装层析装置，开始洗脱，其洗脱速度 为Imin/mU每管洗脱3min，共收集40管后，将含有多糖的洗脱液收集一起，减压浓缩后，低 溫冻干，即为EP。
[0012] 2、根据权利要求1所述的稱苔多糖的制备方法，其特征在于，还包括如下步骤：在 第5)步之后对其进行乙醇分级纯化：将EP溶液加入无水乙醇，使其乙醇终浓度为40%， 4°C过夜沉淀多糖，30(K)r/min离屯、15min后，分离上清液和沉淀，低溫冻干沉淀即为EPl; 再向上清液中加入无水乙醇，使其终浓度达到60 %后，4°C过夜沉淀多糖，600化/min离屯、 15min，再次分离上清液和沉淀，低溫冻干沉淀即为EP2;再向剩余的糖液中加入无水乙醇， 待乙醇浓度达到80%时，4°C过夜收集沉淀，低溫冻干即为EP3。
[0013] 3、根据权利要求1或者2所述的稱苔多糖的应用。
[0014] 经测定，本发明的分离、纯化的稱苔多糖EP2含糖醒酸22. 60%，硫酸根20. 49%。 单糖组成为鼠李糖76. 7mg/kg，半乳糖21. 5mg/kg，葡萄糖10. 3mg/kg，木糖9. 5mg/kg。本发 明提供一种方法简单、性能稳定、成本低廉、药用价值大，能提高免疫力等特点的一种稱苔 多糖其制备方法。尤其是采用提取、纯化的制备方法，W及体外免疫活性筛选和免疫抑制动 物实验，获得稱苔多糖及其提炼方法，阐明了此种稱苔多糖可增强免疫抑制小鼠的免疫功 能的作用，为有效地开发了稱苔的药用价值和用途，治理环境污染，降低清理成本，提高社 会和经济效益提供了新方法。
【附图说明】
[001引图1 :稱苔多糖组分对T、B淋己细胞增殖影响
[0016] 其中：A、多糖组分对T淋己细胞增殖的影响；B、多糖组分+ConA对T淋己细胞增 殖的影响C、多糖组分对B淋己细胞增殖的影响；D、多糖组分+ConA对B淋己细胞增殖的影 响。其中：A、C组中刺激组与空白组比较#邮< 0. 01，多糖组与空白组比较*p< 0. 05，**p < 0.0 l ;而B、D组中刺激组与空白组比较#邮<0.0 l ;协同组与刺激组比较*p<0. 05， **p< 0.0 l
[0017] 图2:稱苔多糖组分对Mcp细胞增殖影响
[0018] 其中：A、多糖组分对Mcp细胞增殖的影响；B、多糖组分+LI^对Mcp细胞细胞增殖 的影响，其中：A组中刺激组与空白组比较#邮< 0. 01，多糖组与空白组比较*p< 0. 05，**p < 0.Ol;而B组中刺激组与空白组比较#邮< 0.Ol;协同组与刺激组比较*p< 0. 05,**p < 0.Ol
[0019] 图3:稱苔多糖组分对M(p细胞分泌NO的影响作用
[0020] 其中：A、多糖组分对Md)细胞分泌NO的影响；B、多糖组分+LI^对Md)细胞分泌NO 的影响。其中：A组中刺激组与空白组比较#邮< 0.01，多糖组与空白组比较*p< 0.05， **p< 0.Ol;而B组中刺激组与空白组比较#邮< 0.Ol;协同组与刺激组比较*p< 0. 05， 和咕< 0.Ol
[0021] 图4 :稱苔多糖在T淋己细胞中的分布（IOOX)
[0022] 其中：A空白对照组，BEP2处理组，CConA处理组，DEP化ConA处理组。 阳02引图5 :稱苔多糖在B淋己细胞中的分布（IOOX)
[0024] 其中：A.空白对照组；B.EP2处理组；C.LPS处理组；D.EP化LPS处理组 阳02引图6 :稱苔多糖在Md)细胞中的分布（40X)，
[0026] 其中：A.空白对照组；B.EP2处理组；C.LPS处理组；D.EP化LPS处理组组
[0027] 图7 :稱苔多糖对T淋己细胞RNA合成的影响（IOOX)。
[0028] 其中：A.空白对照组；B.EP2处理组；C.ConA处理组；D.ConA巧P2处理组
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