体实施方式】
[0029] 下面结合实施例对本发明进行进一步阐释和说明。
[0030] 1)本发明所述稱苔多糖的制备方法详细说明。
[0031] 大致而言，稱苔多糖的分离提取纯化包括如下步骤，脱脂干燥一 90°C水提一过滤 一浓缩一乙醇沉淀一脱蛋白一去小分子杂质一脱色素一纯化一真空干燥一多糖纯品。具体 到本发明是按照W下的步骤进行的。 阳0巧 （1)稱苔粗多糖的提取：称取适量稱苔干粉，按固液比1 :20加入单蒸水，90°C恒溫 浸泡化，纱布过滤，得到滤液，反复提取2次，将上述滤液合并（体积为V)，旋转蒸发浓缩至 至1/4V(体积为VI)，缓慢加入3V1乙醇（95% )，同时快速揽拌，防止杂质絮凝，4°C冰箱静 置过夜，次日将醇沉提取物在3500r/min离屯、15min，弃上清液，合并沉淀，低溫真空干燥， 得到稱苔粗多糖。
[0033] (2)稱苔粗多糖的脱蛋白：将稱苔粗多糖溶于蒸馈水，于60°C水浴中加热溶解，冷 却后调整溶液抑值到6. 5,加入木瓜蛋白酶，溶液中稱苔粗多糖终浓度为3%，50°C恒溫水 浴2.化后，将溶液于90°C，加热5min，灭活木瓜蛋白酶，冷却至室溫后，加入1/4V的Sevage 试剂（氯仿：正下醇=4 :1)，反复震荡萃取30min后，300化/min离屯、15min，溶液分层，收 集最上层溶液，反复多次萃取，直到没有凝胶层为止，减压浓缩除掉上清液中有机试剂。
[0034] (3)稱苔多糖中色素及小分子杂质去除：先用浓氨水调整多糖液抑至8.0,再向 其中加入10%的过氧化氨溶液同时快速揽拌，直至溶液变为淡黄色，50°CW下保溫化脱色 素，降至室溫，将多糖溶液于eOOOr/min离屯、15min，去除小分子杂质。
[0035] (4)稱苔多糖透析除盐：将多糖溶液装入阻滞分子量为3500化的透析袋里，用蒸 馈水透析，化后更换一次透析液，4°C过夜。次日用8000化的聚乙二醇浓缩糖液至1/3体积 后，反复用蒸馈水清洗透析袋表面，收集浓缩的多糖溶液，低溫干燥，得稱苔多糖的粗制品。
[0036] (5)稱苔多糖纯化：将稱苔多糖的粗制品加热溶解于蒸馈水中，多糖浓度为50mg/ mU打开Se地acr^-300层析柱打开水口，待液面几乎于柱床平齐时，关闭出水口，轻缓加 入5mL多糖溶液，防止冲击基质，再次打开开关，待样品刚好与柱床相平时，关闭阀口，用少 量蒸馈水冲洗基质表面及层析柱管壁，打开阀口，待液面于柱床平齐时，关闭阀口，缓慢加 入蒸馈水，充满整个层析柱后，安装层析装置，开始洗脱，其洗脱速度为Imin/mU每管洗脱 3min，共收集40管后。利用硫酸-苯酪法测定各管溶液的多糖含量，绘制洗脱曲线，将含有 多糖的洗脱液收集一起，减压浓缩后，低溫冻干，即为EP。
[0037] (6)稱苔多糖分级沉积：将EP溶液加入无水乙醇，使其乙醇终浓度为40%，4°C过 夜沉淀多糖，30(K)r/min离屯、15min后，分离上清液和沉淀，低溫冻干沉淀即为EPl;再向上 清液中加入无水乙醇，使其终浓度达到60%后，4°C过夜沉淀多糖，60(K)r/min离屯、15min， 再次分离上清液和沉淀，低溫冻干沉淀即为EP2 ;再向剩余的糖液中加入无水乙醇，待乙醇 浓度达到80%时，4°C过夜收集沉淀，低溫冻干即为EP3。
[0038] 经检验，按照本发明所述方法制备和分级提取的稱苔多糖巧巧及乙醇分级后的 稱苔多糖（EP1、EP2、EP3)的各组分的总糖含量、糖醒酸含量、蛋白质含量和硫酸根含量如 下表所示。
[0040] 2)本发明制备的稱苔多糖免疫活性组分的筛选及其对淋己细胞免疫增值能力影 响
[0041] 为了筛选出按照上述方法制备的各稱苔多糖组分中具有免疫活性的组分，采用体 外实验方法，先将BALB/c小鼠T、B、Md)细胞分离，进而进行细胞培养，检测稱苔多糖组分 对T、B、M(1)运=种重要淋己细胞增殖能力的影响。我们得出如下结论：稱苔多糖EP2显著 促进B淋己细胞增殖与母细胞化，有促进T淋己细胞和巨隧细胞增殖的趋势。采用环憐酷 胺诱导建立了小鼠免疫抑制模型，EP2进行灌胃。发现邸2能显著改善免疫抑制小鼠免疫 器官指数、巨隧细胞吞隧功能、迟发性超敏反应、淋己细胞转化功能、相关细胞因子及抗体 水平，W及T细胞亚群的稳态。EP2可望成为一种无毒副作用的免疫增强剂，稱苔多糖具有 重要的开发应用前景。
[0042] (1化P、EP1、EP2和EP3四种稱苔多糖组分对T、B和淋己细胞和Md)细胞增殖活性 的作用（结果如图1、2所示）
[0043] 每种细胞均设空白对照组、多糖组、丝裂原组W及多糖+丝裂原组，各组体系 均为200y以每组中均加入处理好的T、B淋己细胞或Md)细胞悬液100y以空白对照 用RPMI-1640完全培养液补充到200yL;丝裂原组分别加入IOyLConA或LPS，再用 RPMI-1640培养液补足到200yLConA或LPS终浓度分别为5yg/mL或10yg/mL;多糖组 由EP、EPl、EP2和EP3四种多糖组分构成，每个组分均设6个浓度梯度，多糖终浓度分别为 50、100、200、300、400、500yg/mL;稱苔多糖+丝裂原组由EP、EP1、EP2和EP3四种多糖组 分和丝裂原（ConA或LP巧组成，每个多糖组设6个浓度梯度，每种多糖组分终浓度分别为 50、100、200、300、400、500yg/mL，ConA或LPS终浓度分别为 5yg/血和 10yg/mL。每个孔 均设=个重复，于37°C，5%C02条件下解育4她，在细胞培养结束前地，向所用孔中都加入 MTT20化，吸弃上清，每孔加入IOOyLDMS0,轻微震荡lOmin，于读取570皿下吸光值。结 果显示：不同多糖组分促进T淋己细胞增殖的效果存在差异，EP2效果最显著（P< 0. 05)。 稱苔多糖各组分均能显著促进B淋己细胞增殖，EP2作用效果最显著（P< 0. 05)，EP3次之 (口<0.05)，6口1作用效果不明显，即6口2>￡口3>￡?>￡口1。 W44] (2) 4种稱苔多糖组分对M夺细胞NO分泌的影响（结果如图3所示）
[0045] 每种多糖组分均设空白对照组、多糖组、撕裂原组W及多糖+丝裂原组，各组体 系均为200yL各组体系组成均参考3. 3. 4,放置37°C，5 %C02条件下解育2地，每孔吸 取50JiL细胞上清液，依次加入室溫下GriessReagentI和GriessReagentII溶液 各50yL，于540nm处测出其相应的吸收光，通过NO的线性回归曲线计算出M聲细胞NO释 放量，从而可W评价多糖对巨隧细胞活化作用。将各组数据利用SPSS2.0软件处理，用 LinearRegression方法分析各组数据的线性回归方程，WR2表示方程的相关系数。结果 表明：，所有的多糖组分均可W促进Md)细胞分泌NO,而且效果均极其明显（P< 0.01)，呈 现一定量效关系，其中EP2在500yg/血的作用效果最佳，比其他组分作用效果明显。
[0046] 做淋己细胞和Md)细胞中多糖的分布（PAS染色法）
[0047] 调整T和B细胞悬液，使其浓度均达到1X107个/血，向24孔细胞培养板中分别 加入100yL细胞悬液，每种细胞均设空白对照组、稱苔多糖组巧P2终浓度400yg/mL)、丝 裂原刺激组（ConA或LI^终浓度分别为5yg/mL和10yg/mL)、稱苔多糖+丝裂原组巧P2 终浓度400yg/mL，ConA或LI^终浓度分别为5yg/mL和10yg/mL)，用RPMI-1640完全培 养基将每孔补足到500y以于37°C，5%C02条件下解育4化后，吹打吸出细胞悬液，离屯、洗 涂，制作涂片，10%甲醒固定20min，洗涂惊干涂片，按照多糖染色（PSA)试剂盒的说明书染 色，封片、镜检。 W48] 将200yL巨隧细胞悬液（3X106个/mL)吸入装入灭菌玻片的六孔板中，每孔体 系为1血，均设为设空白对照组、稱苔多糖组