巧P2终浓度400yg/mL)、丝裂原刺激组（LPS 终浓度为10yg/mL)、稱苔多糖+丝裂原组巧P2终浓度400yg/mL，LPS终浓度为10yg/ 血)，用RPMI-1640完全培养基将每孔补足到1血，37°C，5%C02培养4她，用PBS淋洗细胞 爬片，再用甲醒溶液（10%)固定细胞20min，洗涂惊干细胞爬片按照多糖染色（PSA)试剂 盒的说明书染色，封片、镜检。
[0049] B、D组为多糖组，且细胞中染色较其他俩组深，是由于细胞内的多糖可W被西弗式 染液染成桃红色，从图4、5中可W说明，多糖作为一种有益的营养物质被细胞吸收到细胞 内部，也说明多糖对于细胞的作用部位也在细胞内，从而推翻了关于多糖是通过细胞膜作 用于淋己细胞运个猜想，但是对于进入到细胞内部的具体作用还需要进一步深入研究。
[0050] (4)淋己细胞和Md)细胞中RNA的检测（甲基绿-派洛宁染色法） 阳05U 取T、B淋己细胞、Md)细胞悬液，方法同（3) -样，制作细胞涂片与爬片，10%多聚 甲醒固定20min后，用甲基绿-派洛宁染色30min，大量的单蒸水冲洗干净后，封片、镜检，观 察T、B淋己细胞中RNA的分布。 阳0巧通过图6、7可知，加入多糖组的B淋己染色要比对照组稍深，说明多糖能够增强B淋己细胞中RNA的含量，能够加强其代谢合成，而加入多糖协同刺激T、B淋己细胞时，可W 发现T、B淋己细胞明显要比刺激组的深，说明增强刺激剂对淋己细胞的刺激作用，增强淋 己细胞中RNA的合成，从而可能增强其相应的免疫功能。
[0053] 3化P2在免疫抑制小鼠上的应用
[0054] (1)将60只B油1/c小鼠（SPF级，体重20±2g，6-8w)随机分成6组，即空白对照 组、免疫抑制模型组、EP2低剂量治疗组、EP2高剂量治疗组。在免疫抑制模型制备第S天， 各处理组的小鼠进行多糖灌胃，每天1次，为期14d，EP2低剂量治疗组按照50mg/kg/d灌胃 EP2 ;EP2高剂量治疗组按照150mg/kg/d灌胃EP2 ;免疫抑制模型组则用相同容积生理盐水 灌服。
[0055] 似EP2对小鼠免疫器官及血象的影响：125mg/kg的EP2可W明显减轻CTX对脾脏 及胸腺细胞的毒性作用，使胸腺指数几乎能恢复到正常水平，而且对脾脏具有反弹式恢复 的功能。2125mg/kgEP2可W明显提高了WBC、LY和PMBC的数量，反弹式的增强骨髓造血 功能。
[0056] 做EP2对小鼠腹腔巨隧功能的影响：125mg/kgEP2对CTX括抗效果更好，使Md) 吞隧率W及吞隧指数分别提高了 31%和39%，所WEP2可W显著改善免疫抑制小鼠的Md) 的功能及Md)比例。
[0057] (4化P2对小鼠迟发性超敏反应值HT)的影响：50mg/kgEP2和125mg/kgEP2均能 显著提高免疫抑制小鼠Thl细胞活性，对免疫抑制小鼠的耳肿度和肿胀率恢复效果非常显 著。
[0058] 巧化P2对小鼠T、B淋己细胞转化作用的影响：50mg/kgEP2和125mg/kgEP2都可 W括抗CTX对淋己细胞毒性作用，而且效果都非常显著。
[0059] 化化P2对小鼠特异性免疫应答的影响：125mg/kgEP2可W明显缓解CTX对T细胞 的毒性，尤其是括抗了对Tc细胞损害，使得T细胞数量显著增加，从而减小了CD4+比例，提 高CD8+的比例，通过运种双向调整使CD4+/CD8+的值下降，逐步恢复免疫抑制小鼠T细胞 亚群的稳态。 W60] (7化P2对小鼠相关细胞因子的影响：125mg/mLEP2明显提高了比-2、INF-丫和 IL-4水平，分别提高了 17. 8%、32. 8%、14. 4%，提示EP2对Thl细胞因子调节程度要明显 高于证2类细胞因子，从而说明EP2可W改善W体液免疫为主的证2免疫应答反应，同时也 大大增强了机体Thl免疫应答反应。
【主权项】
1. 一种具有增强免疫功能浒苔多糖的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行： 1) 浒苔粗多糖提取：称取浒苔干品，加入20倍水，于90°C提取三次，每次2h，纱布过 滤，取浸提液旋转蒸发浓缩到原体积1/6,再加入3倍体积95%乙醇，4°C过夜，得白色絮状 沉淀，冷冻干燥，即为浒苔粗多糖； 2) 浒苔粗多糖脱蛋白：将浒苔粗多糖溶于蒸馏水，于60°C水浴中加热溶解，冷却后调 整溶液pH值到6. 5,加入木瓜蛋白酶，浒苔粗多糖终浓度为3%，50°C恒温水浴2. 5h后，将 溶液于90°C，加热5min，灭活木瓜蛋白酶，冷却至室温后，加入1/4V的Sevage试剂、即氯 仿：正丁醇为4 :1的试剂，反复震荡萃取30min后，3000r/min离心15min，溶液分层，最上层 是多糖溶液，中间凝胶层即为变性的蛋白质，最下层为有机溶剂，收集最上层溶液，反复多 次萃取，直到没有凝胶层为止，减压浓缩除掉上清液中有机试剂； 3) 高速离心法去除小分子杂质：先用浓氨水调整多糖液pH至8.0,再向其中加入10% 的过氧化氢溶液同时快速搅拌，直至溶液变为淡黄色，50°C以下保温2h脱色素，降至室温， 将多糖溶液于6000r/min离心15min，去除小分子杂质； 4) 氧化法脱去色素：将多糖溶液装入阻滞分子量为3500Da的透析袋里，用蒸馏水透 析，2h后更换一次透析液，4°C过夜；次日用8000Da的聚乙二醇浓缩糖液至1/3体积后，反 复用蒸馏水清洗透析袋表面，收集浓缩的多糖溶液，低温干燥，得浒苔多糖的粗制品； 5. Sephacry1 -300凝胶层析柱纯化多糖：将消1苔多糖的粗制品加热溶解于蒸馏水中， 多糖浓度为50mg/mL，打开Sephacryl-300层析柱打开水口，待液面几乎于柱床平齐时，关 闭出水口，轻缓加入5mL多糖溶液，防止冲击基质，再次打开开关，待样品刚好与柱床相平 时，关闭阀门，用少量蒸馏水冲洗基质表面及层析柱管壁，打开阀门，待液面于柱床平齐时， 关闭阀门，缓慢加入蒸馏水，充满整个层析柱后，安装层析装置，开始洗脱，其洗脱速度为 Imin/mL，每管洗脱3min，共收集40管后，将含有多糖的洗脱液收集一起，减压浓缩后，低温 冻干，即为EP。2. 根据权利要求1所述的一种具有增强免疫功能浒苔多糖的制备方法，其特征在于， 还包括如下步骤：在第5)步之后对其进行乙醇分级纯化：将EP溶液加入无水乙醇，使其乙 醇终浓度为40 %，4°C过夜沉淀多糖，3000r/min离心15min后，分离上清液和沉淀，低温冻 干沉淀即为EP1 ;再向上清液中加入无水乙醇，使其终浓度达到60%后，4°C过夜沉淀多糖， 6000r/min离心15min，再次分离上清液和沉淀，低温冻干沉淀即为EP2 ;再向剩余的糖液中 加入无水乙醇，待乙醇浓度达到80%时，4°C过夜收集沉淀，低温冻干即为EP3。3. 根据权利要求1或者2所述的浒苔多糖在增强淋巴细胞免疫方面的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种具有增强免疫功能浒苔多糖的制备方法及其应用。该浒苔多糖的制备方法包括浒苔粗多糖提取、浒苔粗多糖脱蛋白、高速离心法去除小分子杂质、高速离心法去除小分子杂质、氧化法脱去色素以及Sephacryl-300凝胶层析柱纯化多糖等步骤。本发明提供了一种方法简单、性能稳定、成本低廉、药用价值大，能提高免疫力等特点的一种浒苔多糖其制备方法。尤其是采用提取、纯化的制备方法，以及体外免疫活性筛选和免疫抑制动物实验，获得浒苔多糖及其提炼方法，阐明了此种浒苔多糖可增强免疫抑制小鼠的免疫功能的作用，为有效地开发了浒苔的药用价值和用途，治理环境污染，降低清理成本，提高社会和经济效益提供了新方法。
【IPC分类】C08B37/00, A61P37/04, A61K31/715
【公开号】CN105294871
【申请号】CN201510624107
【发明人】冷扬, 鲍波, 陈一淑, 朱少平, 李晓玲
【申请人】广东医学院
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年9月25日