一种快速检测瓜果腐霉菌的荧光定量pcr检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于荧光定量PCR法检测瓜果腐霉菌的试剂盒，专用于检测瓜果 腐霉囷，属于农作物病害诊断与防治技术领域。
【背景技术】
[0002] 瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum)，属鞭毛菌亚门真菌。菌丝体生长繁茂，呈白 色棉絮状。菌丝无色，无隔膜，直径2.3-7. Ιμπι。菌丝与孢囊梗区别不明显。孢子囊丝状 或分枝裂瓣状，或呈不规则膨大，大小63-725 X 4. 9-14. 8 ( μ m)。泡囊球形，内含6-26个游 动孢子。藏卵器球形，直径14. 9-34. 8 μ m。卵孢子球形，平滑，不满器，直径14. 0-22. 0 μ m。 该菌在年平均气温高的地方出现频率较高。病菌以卵孢子在12-18cm表土层越冬，并在土 中长期存活。翌春，遇有适宜条件萌发产生孢子囊，以游动孢子或直接长出芽管侵入寄主。 此外，在土中营腐生生活的菌丝也可产生孢子囊，以游动孢子侵染幼苗，引起茄子、番茄、辣 椒和黄瓜等作物的猝倒病。田间的再侵染主要靠病苗上产出孢子囊及游动孢子，借灌溉水 或雨水溅附到贴近地面的根茎上引致更严重的损失。
[0003] 瓜果腐霉菌传统鉴定方法通常采用选择性培养基进行病原菌的分离培养，菌落形 态观察，显微镜下观察病菌的菌丝体，孢子等特征，结合田间发病植株症状的观察进行分 类。传统鉴定方法在很多方面存在一定误差和困难，具有很大局限性且费时费力。仅菌丝 体和孢子等的形态特征也即表型分析来鉴别，有时是不准确的。同一病原菌的菌落往往在 形态上、分布、生理性状等方面存在一定差异，难以进行准确鉴定。随着分子生物学技术的 日益成熟和广泛应用，人们有可能避开传统的分离培养过程，通过DNA水平上的研究，对土 壤中病原菌进行鉴定。分子生物学方法的简便、快速、高效、可靠等特点，是传统的分离培养 方法所达不到的。
[0004] 实时焚光定量 PCR技术（real-time fluorescent quantitative PCR，FQ_PCR)是 一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，通过扩 增产物熔解曲线分析可以特异的检测和鉴定某种病原真菌，通过标准曲线对未知模板进行 定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠 性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛 应用于分子生物学研究和医学研究等领域，但在农业植物病原真菌的定性定量检测研究中 应用较少，尤其是在瓜果腐霉菌的定性定量研究中。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服瓜果腐霉菌传统检测鉴定方法的不足，提供一种PCR快速 检测瓜果腐霉菌的方法，采用根据瓜果腐霉菌rDNA的ITS区所设计的特异性引物进行扩 增，得到282bp条带，同时本发明优化荧光定量PCR反应体系，实现对发病植物组织及果实 中的瓜果腐霉菌的快速检测定量，提高了检测的准确性，节约了检测时间，可以试剂盒的形 式在植物病害诊断与防治领域大规模推广。
[0006] -种PCR快速检测瓜果腐霉菌的方法，以瓜果腐霉菌DNA为模板进行PCR反应，其 特征在于，所述PCR反应体系中加入有一对特异性引物GF1F/GF1R，该特异性引物的序列分 别为：
[0007] 特异性引物 GF1F :5' -GCAACCTCTATTGGCGGTATG-3'，
[0008] 特异性引物 GF1R :5' -ATATCAGGTCCAATTAGAAAGTTGTTC-3'。
[0009] 所述PCR反应体系终体积为20yL，其中10XPCR buffer 2yL，0. 5yL浓度为 15mM 的 MgCl2,1· 6 μ L 浓度为 2. 5mM 的 dNTPs，5 μ Μ 的引物各 0· 5 μ L，5U/ μ L 的 Taq 酶 0. 2 μ L，DNA模板2 μ L，灭菌双蒸水12. 7 μ L ;PCR反应扩增程序为：94°C预变性3min ;94°C 变性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸lmin，共30个循环；最后72°C延伸lOmin。
[0010] 所述PCR快速检测为实时荧光定量PCR检测。
[0011] 所述PCR反应体系中加入有SYBR Green Supermix〇
[0012] 所述 PCR 反应总体积为 20 μ L，SYBR Green Supermix 10 μ L，1 μ L 浓度为 10 μ Μ 的特异性引物GF1F，1 μ L浓度为10 μ Μ的特异性引物GF1R，DNA模板2 μ L，余量为无菌双 蒸水6 μ L ;荧光定量PCR反应程序：
[0013] 第 1 步：95. 0°C 3 分钟，
[0014] 第 2 步：95. 0°C 10 秒钟，
[0015] 第 3 步：58. 0°C 30 秒钟，
[0016] 第4步：进行第2步程序，重复39次循环，
[0017] 第5步：熔解曲线65. 0°C至95. 0°C，每5秒钟增加0. 5°C，
[0018] 第6步：结束。
[0019] 所述瓜果腐霉菌DNA来自植物组织、果实或土壤。
[0020] -种瓜果腐霉菌的试剂盒，包括一 PCR反应体系，所述PCR反应体系中含有特异性 引物GF1F/GF1R，该特异性引物的序列分别为：
[0021] 特异性引物（GF1F) :5' -GCAACCTCTATTGGCGGTATG-3'，
[0022] 特异性引物（GF1R) :5' -ATATCAGGTCCAATTAGAAAGTTGTTC-3'。
[0023] 所述PCR反应体系还包括焚光基团SYBR Green Supermix。
[0024] 所述PCR反应体系为：SYBR Green Supermix 10 μ L，1 μ L浓度为10 μ Μ的特异性 引物GF1F，1 μ L浓度为10 μ Μ的特异性引物GF1R，无菌双蒸水6 μ L ;反应时需加入的待测 瓜果腐霉菌DNA模板为2 μ L。
[0025] 本发明采用根据瓜果腐霉菌rDNA的ITS区所设计的特异性引物进行扩增，得到 282bp条带，同时本发明优化荧光定量PCR反应体系，反应体系总体积为20 μ L，SYBR Green Supermix 10 μ L，上游引物 GF1F (10 μ Μ) 1 μ L，下游引物 GF1R (10 μ Μ) 1 μ L，DNA 模板 2 μ L， 余量为无菌双蒸水6 μ L。本明实现对发病植物组织及果实中的瓜果腐霉菌的快速检测定 量，提高了检测的准确性，节约了检测时间，可以试剂盒的形式在植物病害诊断与防治领域 大规模推广。
[0026] 本发明提供一种荧光定量PCR法检测瓜果腐霉菌的试剂盒，可对植物组织及土壤 中的瓜果腐霉菌进行快速检测定量。与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0027] 检测准确性高，特异性好，可从植物组织及土壤中准确地检测到瓜果腐霉菌。
[0028] 检测灵敏度高，可检测瓜果腐霉菌DNA浓度低至0. 01ng/mL，对瓜果腐霉菌的精确 检测可达到62个孢子。
[0029] 操作简便快捷，基于对核苷酸的检测，不受培养条件限制。定量检测，能真实反映 瓜果腐霉菌定殖和侵染的情况；可同时进行高通量的样本检测。本发明提供的试剂盒可对 瓜果腐霉菌进行快速定量检测，可以替代一直沿用的分离培养的传统鉴定方法，并适于在 植物病害诊断及防治领域广泛推广应用。
[0030] 因此本发明提供一种荧光定量PCR法检测瓜果腐霉菌的试剂盒，实用性强，可满 足植物病害诊断及监测的需要。
【附图说明】
[0031] 图1为特异性检测引物对GF1F/GF1R对瓜果腐霉菌及其近缘种、属真菌的PCR扩 增结果，其中1-9号为引物对GF1F/GF1R扩增6种病原菌结果：M:Marker II 1.无 DNA对照 2.禾谷镜刀菌（Fusarium graminearum)3.群结腐霉（Pythium myriotylum)4.瓜果腐霉菌 (Pythium aphanidermatum)5.辣椒疫霉（Phytophthora capsici)6.棉疫霉（Phytophthora boehmeriae) 7.立枯丝核菌（Rhizoctonia solani)；
[0032] 图2为瓜果腐霉菌特异引物GF1F/GF1R的灵敏度检测结果，
[0033] 其中1-5号为瓜果腐霉菌DNA模板浓度从高至低系列稀释（10ng/mL-0.001ng/ mL)，M :Marker II ；
[0034] 图3为标准样品和未知样品的瓜果腐霉菌荧光定量PCR扩增曲线图，
[0035] 其中y轴：荧光吸收率；X轴：循环数；
[0036] 图4为标准样品和未知样品的瓜果腐霉菌荧光定量PCR熔解曲线图，图示熔解温 度为86°C ;图5为标准样品和未知样品的瓜果腐霉菌荧光定量PCR标准曲线图，
[0037] 其中未知样品：1.番茄病根（有明显症状，6. 57X 106个孢子），2.番茄茎基部（有 明显症状，4. 33 X 105个孢子），3.番茄病茎（有症状，5. 69X 104个孢子），4.根际土壤1(948 个孢子），5.根际土壤2 (62个孢子）。该结果显示该发明试剂盒及检测方法可灵敏精确地 检测植株病组织及土壤中的瓜果腐霉菌的数量，检测结果可达到62个孢子。
【具体实施方式】
[0038] 下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明
[0039] 实施例1瓜果腐霉菌的特异性引物检测
[0040] 1)各菌株DNA制备：
[0041] 采用平板培养菌株，置于适合温度的培养箱内，生长一周左右，用灭菌的解剖针刮 取菌丝体，收集于