Tpmt基因多态性检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种核酸检测领域，具体涉及一种ΤΡΜΤ基因多态性检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 疏噪呤甲基转移酶（thiopurine S-methyltransferase, ΤΡΜΤ)是一种催化疏噪呤 类药物如6-疏噪呤（6-mercatopurine，6_MP)硫代甲基化的胞衆酶。6-疏噪呤用于急性 淋巴细胞性白血病、绒毛膜上皮癌、恶性葡萄胎等疾病的治疗。在体内6-MP代谢为硫鸟嘌 呤核苷酸（6-TGN)掺入DNA而发挥细胞毒效应，但通过ΤΡΜΤ甲基化可生成无活性的代谢产 物。ΤΡΜΤ活性与6-ΜΡ的疗效和毒性反应相关，ΤΡΜΤ活性低则易引起6-TGN蓄积而产生毒 性反应。
[0003] 研究显示，患者体内ΤΡΜΤ的遗传多态性与嘌呤类药物的疗效和毒性有关，ΤΡΜΤ活 性呈三态分布，人群中约90%的个体为ΤΡΜΤ野生型的高酶活性者；10%的个体为ΤΡΜΤ杂 合子变异者，表现出中等酶活性；〇. 3 %的个体为ΤΡΜΤ纯合子变异者，导致ΤΡΜΤ活性低或 无活性。ΤΡΜΤ杂合子变异者可耐受65%的6-ΜΡ标准剂量，纯合子变异者仅能耐受5%~ 10%的标准剂量。现已发现20余种ΤΡΜΤ基因突变，其中ΤΡΜΤ*2、ΤΡΜΤ*3Α和TPMT*3C最为 常见，占中等酶活性和低酶活性个体的90%以上。活性高的患者长期服用这类药易产生耐 受性，可能增加复发率；活性低的患者即使使用常规剂量的硫嘌呤类药物，也会增加发生严 重的血液学不良反应的风险，甚至会导致患者死亡。因此，在接受6-MP治疗前，患者应该先 接受ΤΡΜΤ基因分型检测，非野生型患者应尽量避免6-MP药物的使用，从而预防严重毒副作 用的发生。
[0004] ΤΡΜΤ基因多态性检测信息如下表所示：
[0005] 表1 :ΤΡΜΤ基因多态性检测信息
[0007] 随着人类医学和药物研究水平的提高，药理遗传学（Pharmacogenetics)日渐兴 起。研究表明，药物在体内的代谢、药物治疗的有效性以及副反应、甚至患者的预后都存在 个体差异，受患者基因背景的影响。因此，应用药理遗传学，在基因水平上研究药物作用的 个体差异，使得个性化治疗这一新一代医学概念成为可能。对药物作用相关基因的检测，可 指导医生对患者准确施药，规避药物副作用，同时提高病人乃至社会的医疗费用效率。
[0008] 荧光定量PCR (聚合酶链式反应）技术是基于传统PCR技术并结合光谱技术而发 展起来的一种更灵敏、更特异、更精确的核酸检测技术。检测结果准确，重复性高，能动态反 应患者治疗前、后病原体动态变化及与临床的关系，且整个过程中避免了传统PCR需后处 理的问题，减少了污染。实时荧光定量PCR技术使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪， 荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号， 通过检测荧光信号的动态变化实时反映 PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软 件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点（即Ct值）以及扩增曲线的 形状，可以判断阴阳性结果；如果同一反应中有已知浓度的定量参考品或标准品，则可以通 过软件自动分析获得标准曲线，由此实现对未知样本的定值（即定量检测）。与传统的PCR 相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针 结构完整时，荧光报告基团发出的荧光能量被淬灭基团吸收，呈现淬灭效应；如果扩增过程 中有靶序列的存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水解切断，荧光报告基团 与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光能量转移效应，荧光报告基团发出的荧光信号被 荧光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。试 验结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果和样本浓 度的定值结果。随着荧光PCR技术的发展，其在TPMT基因突变诊断领域的应用已越来越广 泛，也越来越为人所重视，TPMT基因突变的实验诊断中，实时荧光PCR技术凭借着快速、敏 感、特异等优点显示出了其临床诊断的优越性。
[0009] 等位基因特异PCR(ARMS-PCR)的基本原理是，TaqDNA聚合酶缺少3 - 5外切酶活 性，在一定条件下PCR引物3末端的错配导致产物的急剧减少，针对不同的已知突变，设计 适当的引物可以通过PCR方法直接达到区分突变型和野生型基因的目的。
[0010] 目前，国内尚无基于实时荧光定量PCR技术与ARMS-PCR技术检测TPMT基因多态 性检测的试剂盒应用于临床检测中，因此，TPMT基因多态性检测试剂盒的研究具有重要意 义。
【发明内容】
[0011] 本发明提供了一种操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽的TPMT基因 多态性检测试剂盒，应用该试剂盒，可以对临床血液样本中的TPMT基因多态性进行快速检 测。
[0012] 本发明提供一种TPMT基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述TPMT基因多态性 检测试剂盒包括PCR反应液，其中，所述PCR反应液包括G238C检测反应液、G238G检测反应 液、G460A检测反应液、G460G检测反应液、A719G检测反应液和A719A检测反应液，且上述 6种检测反应液均包括用于靶多核苷酸扩增的上下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针。
[0013] 优选的，所述G238C检测反应液中用于靶多核苷酸扩增的上下游引物的碱基序列 为：
[0014] 上游引物：5' -GTAAATGTATGATTTTATGCAGGTGTC-3' ；
[0015] 下游引物：5 ' -TCTGAGTAAGAAAGATTCTGCTCTGTAA-3 '。
[0016] 优选的，所述G238G检测反应液中用于靶多核苷酸扩增的上下游引物的碱基序列 为：
[0017] 上游引物：5' -GTAAATGTATGATTTTATGCAGGTCTG-3' ；
[0018] 下游引物：5 ' -TCTGAGTAAGAAAGATTCTGCTCTGTAA-3 '。
[0019] 优选的，所述G238C检测反应液和G238G检测反应液中所述用于靶多核苷酸检测 的探针的碱基序列均为：5' FAM-ACCGGGGACACAGTGTAGTTGGTGTG-BHQ13'。
[0020] 优选的，所述G460A检测反应液中用于靶多核苷酸扩增的上下游引物的碱基序列 为：
[0021] 上游引物：5' -TGACATGATTTGGGATAGAGCAA-3' ；
[0022] 下游引物：5 ' -CCTATTTCAAACTCATAGAAGTCTAAGC-3 '。
[0023] 优选的，所述G460G检测反应液中用于靶多核苷酸扩增的上下游引物的碱基序列 为：
[0024] 上游引物：5 ' -TGACATGATTTGGGATAGAGCAG-3 ' ；
[0025] 下游引物：5 ' -CCTATTTCAAACTCATAGAAGTCTAAGC-3 '。
[0026] 优选的，所述G460A检测反应液和G460G检测反应液中所述用于靶多核苷酸检测 的探针的碱基序列均为：5' FAM-TAGTTGCCATCAATCCAGGTGATCGC-BHQ13'。
[0027] 优选的，所述A719G检测反应液中用于靶多核苷酸扩增的上下游引物的碱基序列 为：
[0028] 上游引物：5 ' -TGTCTCATTTACTTTTCTGTAAGGACAC-3 ' ；
[0029] 下游引物：5 ' -GTTGTCTTGAGAAGGTTGATGCTT-3 '。
[0030] 优选的，所述A719A检测反应液中用于靶多核苷酸扩增的上下游引物的碱基序列 为：
[0031] 上游引物：5' -TGTCTCATTTACTTTTCTGTAAGGACAT-3' ；
[0032] 下游引物：5 ' -GTTGTCTTGAGAAGGTTGATGCTT-3 '。
[0033] 优选的，所述A719G检测反应液和A719A检测反应液中所述用于靶多核苷酸检测 的探针的碱基序列均为：5' FAM-AAGACAGTCAATTCCCCAACTI