一株高产葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株高产葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母，属于微生物技术领域。
【背景技术】
[0002]葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，简称G0D，E.C.1.1.3.4)是一种黄素糖蛋白，在有氧条件下能专一性地催化β-D-葡糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。G0D广泛分布于动植物和微生物体内。由于微生物生长繁殖快、来源广，是生产G0D的主要来源，主要生产菌株为黑曲霉和青霉。目前G0D的应用领域不断拓展，国内外市场需求量急剧增加。目前G0D的应用领域不断拓展，国内外市场需求量急剧增加。目前G0D基因已经在毕赤酵母GS115、大肠杆菌、瑞氏木霉等中得到表达，但还未见其在非常规酵母解脂耶氏酵母中进行表达研究，而解脂耶氏酵母被认为是安全的，因此，能用于食品和药物生产上。
[0003]解脂耶氏酵母Pold菌系中，编码能水解其它蛋白质的AEP基因被剔除，使得外源蛋白能更好地表达。人们将Pold系改造，生成一系列的派生菌系，如Polh、Polg、Polf。Polh、Polg在Pold系基础上进行改造，只有一个营养缺陷型基因。Polg被改造为适合以PBR322为基础的质粒整合的菌系，Polh将穿梭质粒的细菌部分在整合入酵母前剔除掉，形成酵母框。它们在Pold系的基础上均被剔除了酸性蛋白酶基因，消除了全部蛋白酶活性。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一株高产葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母，所述解脂耶氏酵母于2015年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为 CCTCC NO:M 2015736。
[0005]所述解脂耶氏酵母可利用蔗糖等廉价碳源，适合高密度发酵，而且解脂耶氏酵母被认为是安全的，可用于食品、SCP等的工业化生产。所述解脂耶氏酵母在以甘油为唯一碳源，3L发酵罐发酵96h后，葡萄糖氧化酶酶活力达到134U/ml。
[0006]所述解脂耶氏酵母是对申请号为2014106530764( —种重组表达葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母及其应用)的专利申请中的重组酵母进行诱变得到的。
[0007]本发明还提供所述解脂耶氏酵母在生产葡萄糖氧化酶方面的应用。
[0008]所述应用是将解脂耶氏酵母种子液体以10%的接种量转接至发酵培养基中，于3L罐上进行发酵培养，甘油补料为30g/l，pH控制5.0，培养温度28°C。
[0009]所述发酵培养基按g/L计含有:甘油20，酵母提取物1.32，氯化铵1.32，磷酸二氢钾0.32，无水硫酸镁0.132，维生素Bi 3.34X 10 4;溶于pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液中。
[0010]所述发酵培养具体是:B1tron 3L罐罐上培养，装液量1L，接种量为10%，于28°C培养，搅拌转速为600rpm，通气量2.0vvm, pH控制5.0，当溶氧第一次反弹且大于60%时，短时流加30g/L的甘油，甘油流速7.5g/h，培养至发酵结束。
[0011]本发明还要求保护所述解脂耶氏酵母在食品或制备药物方面的应用。
[0012]本发明的有益效果:
[0013](1)本发明的解脂耶氏酵母，可利用蔗糖等廉价的作碳源，适合高密度发酵。解脂耶氏酵母被认为是安全的，可用于食品、SCP等的工业化生产；
[0014](2)本发明的解脂耶氏酵母发酵生产葡萄糖氧化酶，培养96h的产量可达134U/ml，生产强度可达1.396U/ (ml.h)。
[0015]生物材料保藏
[0016]解脂耶氏酵母，分类学命名为解脂耶氏酵母T2Yarrowia lipolytica T2，于2015年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2015736o
【具体实施方式】
[0017]主要试剂:蛋白胨和酵母粉购自0X10D公司；SDS_PAGE试剂盒和蛋白质标准分子量购于碧云天生物技术研究所(南通)；其他试剂均为国产分析纯。
[0018]所需培养基:YPD培养基(g/L):葡萄糖20 ;蛋白胨20 ;酵母粉10。YNB培养基(g/L):葡萄糖20 ;ΥΝΒ1.7 ;硫酸铵5。ΡΡΒ培养基(g/L):甘油20 ;酵母提取物1.32 ;氯化铵
1.32 ;磷酸二氢钾0.32 ;无水硫酸镁0.132 ;维生素B13.34X10-4 ;溶于柠檬酸盐缓冲液pH6.0中。固体培养基在此基础上添加2%琼脂粉。
[0019]Y.lipolytica种子培养条件:从_80°C保藏的工程菌甘油管点至YPD固体培养基，28°C培养过夜，用接种针挑取单菌落接种于用250mL三角瓶装有25mL的YPD液体培养基中，于28 °C培养18?24h，转速为200rpm。
[0020]Y.lipolytica发酵培养条件:采用PPB培养基，B1tron 3L罐上培养，装液量1L，接种量为10%，于28°C培养，搅拌转速为600rpm，通气量2.0VVm，pH控制5.0。当溶氧第一次反弹且大于60%时，短时流加30g/L的甘油，甘油流速7.5g/h，培养至发酵结束。
[0021]酶活测定方法:
[0022]酶活力单位定义:在30°C，pH 6.0的条件下，lmin从1 μπιο?的β _D_葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸和H202所需的酶量为一个葡萄糖氧化酶酶活力单位，以U/mL表示。
[0023]试管中加入2.5mL邻联茴香胺溶液，0.3mL的18%葡萄糖，0.lmL的100U/ml辣根过氧化物酶，30°C保温2min后，向试管中加入稀释好的酶液样品0.lmL，反应3min后，加入2mol/L硫酸终止反应。取出试管，测0D500的吸光值，以热失活的酶液做空白对照。
[0024]结果表示与计算:
[0025]X = [ Λ A+(7.5XtX0.1)] X5Xn
[0026]式中:Λ Α一500nm吸光值；t一测定时间，min ；0.1一样品体积，ml ；5一终反应体积，ml ;7.5—消光系数；n—稀释倍数。
[0027]实施例1菌株发酵生产葡萄糖氧化酶
[0028]将本发明的解脂耶氏酵母菌在YPD平板上活化培养一定阶段，接种到种子液体培养基YPD中，20h后以10 %的接种量转接至发酵培养基PPB中，B1tron 3L罐上培养，装液量1L，接种量为10%，于28°C培养，搅拌转速为600rpm，通气量2.0vvm，pH控制5.0。当溶氧第一次反弹且大于60%时，短时流加30g/L的甘油，甘油流速7.5g/h，培养至发酵结束。其培养96h酶活可达到134U/ml。
[0029]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1.一株高产葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母，所述解脂耶氏酵母于2015年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC Μ2015736ο2.根据权利要求1所述的解脂耶氏酵母，其特征在于，所述解脂耶氏酵母的葡萄糖氧化酶产量达134U/ml。3.权利要求1所述解脂耶氏酵母在生产葡萄糖氧化酶方面的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用是将解脂耶氏酵母种子液体以10%的接种量转接至发酵培养基中，于3L罐上进行培养，补料30g/L的甘油，pH控制5.0，培养温度28 °C。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基按g/L计含有:甘油20，酵母提取物1.32，氯化铵1.32，磷酸二氢钾0.32，无水硫酸镁0.132，维生素匕3.34X 10 4；溶于pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液中。6.权利要求1所述解脂耶氏酵母在食品或制备药物方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了一株高产葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母，属于微生物技术领域。本发明的所述解脂耶氏酵母于2015年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC？M？2015736。本发明的菌株可利用蔗糖等廉价的作碳源，适合高密度发酵，而且解脂耶氏酵母被认为是安全的，可用于食品、SCP等的工业化生产。本发明的菌株在以甘油为唯一碳源，3L发酵罐发酵96h后，葡萄糖氧化酶酶活力达到134U/ml。CCTCC NO：M 201573620151210
【IPC分类】C12N1/16, C12N9/04, C12R1/645
【公开号】CN105368728
【申请号】CN201510941376
【发明人】张娟, 陈坚, 刘晓筱, 堵国成, 王彬晨
【申请人】江南大学
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年12月16日