一种栓菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种栓菌及其应用，属于微生物发酵技术领域。
【背景技术】
[0002] 微生物发酵技术通常是生产单一酶制剂，实际应用中又常常将几种酶复配后应 用，但各种酶的复配有可能会影响彼此的酶学性质，因此，发酵液含多种酶的体系能得到更 好的应用。
[0003] 中国专利公布号CN102268379A，公布日2011年12月07日，发明名称为"一种毛 栓菌及其产纤维素酶的方法"，该发明公开了毛栓菌发酵产纤维素酶的方法，成功测得纤维 素酶酶活，该发明的不足之处在于粗酶液中仅含一种酶，较单一。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述问题，本发明提供一种可产多种酶的栓菌（Trametes sp. LEF01)及 其应用。
[0005] 该菌于2015年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 CGMCC，保藏号为 CGMCC No. 10489。
[0006] 所述栓菌可同时产漆酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶，可以马铃薯提取液和葡 萄糖为主要原料进行振荡培养发酵产酶。该菌发酵产酶，漆酶酶活4100. 8U/L，纤维素酶酶 活2310U/L，半纤维素酶酶活21271. 8U/L，果胶酶酶活19800U/L。
[0007] 所述栓菌是从土壤中分离得到的。
[0008] 本发明还提供一种利用所述栓菌发酵产酶的方法，是将栓菌CGMCC No. 10489活化 后，接入马铃薯液体培养基中，在28°C、150rpm的条件下振荡培养6天，离心取上清即得粗 酶液。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述粗酶液中含有漆酶、纤维素酶、半纤维素酶、果 胶酶粗酶。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述马铃薯液体培养基的制备方法：每L的配方，取 去皮马铃薯200g、切块、煮沸、过滤，然后补足至1L，并加入20.0 g葡萄糖。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是：称取去皮马铃薯200g，切成小块， 加水1.0 L煮沸20~30min，4层纱布过滤滤去马铃薯块，将滤液补足至I. 0L，加入20.0 g葡 萄糖；分装后121°C高压灭菌20~30min后，冷却，无菌操作，接入在PDA斜面培养基上已培 养5~6天的CGMCC No. 10489菌株的菌悬液，在恒温振荡培养箱内28~30°C条件下振荡 培养6天，转速为150rpm，发酵结束，发酵液4000rpm离心30min，得到的上清液为粗酶液。
[0012] 本发明还要求保护所述栓菌在生产漆酶、纤维素酶、半纤维素酶或果胶酶方面的 应用，所述栓菌发酵生产得到的漆酶、纤维素酶、半纤维素酶或果胶酶，以及所述栓菌在纺 织领域的应用。
[0013] 本发明的有益效果：
[0014] (1)本发明的栓菌培养基简单，原料主要为马铃薯和葡萄糖；培养操作容易，接种 后振荡培养。
[0015] (2)本发明得到的粗酶液为多种酶粗酶液体系，漆酶酶活4100. 8U/L，纤维素酶酶 活2310U/L，半纤维素酶酶活21271. 8U/L，果胶酶酶活19800U/L。本发明的菌株和粗酶液应 用前景大。
[0016] 生物材料保藏：
[0017] -种栓菌，分类学命名为栓菌Trametes sp.，于2015年5月18日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏号为CGMCC No. 10489,保藏地址为北京 市朝阳区北辰西路1号院3号。
【附图说明】
[0018] 图1.栓菌（Trametes sp. LEF01)的红色氧化圈；
[0019] 图 2.栓菌（Trametes sp. LEF01)的发酵体系。
【具体实施方式】
[0020] 酶活测定方法：
[0021] (1)漆酶酶活
[0022] 定义：Imin内氧化ABTS生成1 μ mol ABTS自由基所需酶量为1个酶活单位。
[0023] 测定方法：以ABTS (2, 2' -二氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）铵盐）为底物测 定漆酶酶活，即取2mL 0· 5mmol/L ABTS溶液（用ρΗ5· 0,浓度为0· 05mol/L的醋酸-醋酸钠 缓冲液配制），空白样用等量缓冲溶液替代，37°C预热，加入ImL粗酶液，测定420nm处吸光 度变化率。漆酶酶活=吸光度变化率X反应液体积X1000X稀释倍数/摩尔吸光数。
[0024] (2)纤维素酶酶活
[0025] 定义：Imin内产生1 μ mol葡萄糖所需的酶量为1个酶活单位。
[0026] 测定方法：利用DNS法（3, 5-二硝基水杨酸法）测定纤维素酶酶活，即取0. 2mL粗 酶液，加入I. 8mL质量分数0· 625%羧甲基纤维素钠（CMC-Na)溶液（用pH为4. 8,0· 2mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲溶液配制），空白样加入等量醋酸-醋酸钠缓冲溶液，于50°C反应30min 后立即加入2mL DNS试剂，沸水浴IOmin显色，冷却，稀释定容至一定倍数，充分混勾，测定 550nm处吸光度。纤维素酶酶活=葡萄糖浓度X反应液体积X1000X稀释倍数/反应时 间。
[0027] (3)半纤维素酶酶活
[0028] 定义：Imin内产生1 μ mol木糖所需的酶量为1个酶活单位。
[0029] 测定方法：利用DNS法测定半纤维素酶酶活，即取ImL粗酶液，加入2mL质量分数 为0. 5 %的木聚糖悬浮液（用pH4. 8,浓度0. 05mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液配制），空 白样加入等量醋酸-醋酸钠缓冲溶液，在60°C下处理30min后立即加入2mLDNS试剂终止 反应，沸水浴IOmin显色，冷却至室温，稀释定容至适当体积，混合均匀后测定540nm处吸光 度。半纤维素酶酶活计算方法为：根据木糖标准曲线得到木糖浓度，半纤维素酶酶活=木糖 浓度X反应液体积X 1000X稀释倍数/反应时间。
[0030] (4)果胶酶酶活
[0031] 定义：Imin内使聚半乳糖醛酸催化裂解产生1 μ mol不饱和半乳糖醛酸的酶量。
[0032] 测定方法：以果胶为底物测定果胶酶酶活，即取ImL粗酶液，加入2mL 0. 2%果胶 的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（PH9. 4)，空白样加入等量pH9. 4的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液， 45°C水浴中反应15min，加入0· 03mol/L的磷酸3mL，测定235nm处吸光值。果胶酶酶活计 算方法为：果胶酶酶活=酶活测定值X反应液体积X1000X稀释倍数/反应时间。
[0033] 实施例1 :栓菌的分离与鉴定
[0034] 样品采集自无锡长广溪国家湿地公园的土壤，溶于生理盐水（0.9%氯化钠溶 液），4000rpm离心15min。取上清液ImL溶于9mL无菌水中，依次稀释10~IO 5倍，倒入PDA 平板培养基上，培养2~3天。挑取单菌落接种到PDA-愈创木酚培养基上（添加0. 01 %愈 创木酚的PDA培养基）进行复筛，选取出现红色氧化圈的菌落（图1)，接种到PDA斜面上保 存。
[0035] 对该菌株进行基因组DNA抽提，PCR扩增及纯化、测序（结果如SEQ ID NO: 1所 示），鉴定为栓菌属（Trametes)，命名为Trametes sp.LEFOl。该菌株已于2015年5月 18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏号为CGMCC No.10489。
[0036] 实施例2 :栓菌发酵产酶
[0037] 称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1.0 L煮沸30min，4层纱布过滤滤去马铃薯 块，将滤液补足至1.〇1，加入20.08葡萄糖。分装后121°(：高压灭菌2〇1^11后，冷却，无菌操 作，接入在PDA斜面培养基上已培养5~6天的Trametes sp. LEFOl菌株的菌悬液，在恒温 振荡培养箱内28°C条件下振荡培养6天，转速为150rpm，发酵结束，发酵液4000rpm离心 30min，得到的上清液为粗酶液（图2)。
[0038] 测上清液酶活，得漆酶酶活630. 6U/L，纤维素酶酶活1108. 9U/L，半纤维素酶酶活 3844. 9U/L，果胶酶酶活 520. 7U/L。
[0039] 在上述培养基中添加 Ig木质素磺酸盐，其他步骤一样。得到的粗酶液中，漆酶酶 活4100. 8U/L，纤维素酶酶活2310U/L，半纤维素酶酶活21271. 8U/L，果胶酶酶活19800U/L。
[0040] 实施例3 :菌株的应用
[0041] 现有的棉织物酶精练技术无论是采用单一酶还是复合酶，在对棉籽壳去除效果上 不理想，特别是对布面棉籽壳较高的织物更是如此（即使润湿性取得不错效果），很多文献 或专利报道回避这一点（不提棉籽壳处理效果）。然而，棉籽壳肉眼可见，是工厂实际生产 中最直观的棉精练效果之一。本发明的菌株所产粗酶液可以解决这些问题。
[0042] 将本发明菌株按照实施例2的方法发酵得到的粗酶液用于棉织物的精练，方法如 下：
[0043] (1)浸乳酶液：采用按照实施例2的方法得到的栓菌CGMCC No. 10489粗酶液，乳 酶温度40°C，酶用量lg/L，渗透剂5g/L，乳酶后织物打卷；
[0044] (2)保温堆置：打卷织物在25°C堆置24小时，堆置过程中织物缓慢转动；
[0045] (3)水洗：织物解卷后于90°C水洗，以去除酶降解的杂质，并兼具使酶失活作用。
[0046] 采用本发明的方法，精练效果好，润湿性：滴水时间小于ls，白度70%以上，强力 损失小于5%，废水COD值为碱精练的10-20% ;经后续常规漂白后布面无棉籽壳残留。
[0047] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种栓菌，于2015年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心CGMCC，保藏号为CGMCCNo. 10489。2. 根据权利要求1所述的栓菌，其特征在于，所述栓菌是从土壤中分离得到的。3. 权利要求1所述栓菌在生产漆酶、纤维素酶、半纤维素酶或果胶酶方面的应用。4. 一种利用权利要求1所述栓菌发酵产酶的方法，其特征在于，所述方法是将栓菌 CGMCCNo. 10489活化后，接入马铃薯液体培养基中，在28°C、150rpm的条件下振荡培养6 天，离心取上清即得粗酶液。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：称取去皮马铃薯200g， 切成小块，加水1. 0L煮沸20~30min，4层纱布过滤滤去马铃薯块，将滤液补足至1. 0L，加 入20. 0g葡萄糖；分装后121°C高压灭菌20~30min后，冷却，无菌操作，接入在PDA斜面培 养基上已培养5~6天的CGMCCNo. 10489菌株的菌悬液，在恒温振荡培养箱内28~30°C 条件下振荡培养6天，转速为150rpm，发酵结束，发酵液4000rpm离心30min，得到的上清液 为粗酶液。6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述粗酶液中含有漆酶、纤维素酶、半纤 维素酶、果胶酶粗酶。7. 权利要求1所述栓菌发酵生产得到的漆酶、纤维素酶、半纤维素酶或果胶酶。8. 权利要求1所述栓菌在纺织领域的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种栓菌及其应用，属于微生物发酵技术领域。本发明的栓菌可产漆酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶，可以马铃薯提取液和葡萄糖为主要原料进行振荡培养发酵产酶。发酵产酶酶活可达：漆酶酶活63.6U/L，纤维素酶酶活1108.9U/L，半纤维素酶酶活3844.9U/L，果胶酶酶活52.7U/L。CGMCC No.1048920150518
【IPC分类】C12R1/645, C12N9/88, C12N1/14, C12N9/42, C12N9/02
【公开号】CN105400707
【申请号】CN201510962896
【发明人】王强, 张颖, 范雪荣, 邵奕文, 王平, 袁久刚, 余圆圆, 崔莉
【申请人】江南大学
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年12月18日