或类似功能的元件。下面通过参考附 图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0045] 首先需要说明的，根据本发明实施例的制备柠檬酸的方法，其所采用的种 子培养基、种子培养条件、发酵培养基和发酵条件均可以为现有的，可参考中国专利 CN104561140A。
[0046] 下面通过具体实施例来阐述根据本发明实施例的制备柠檬酸的方法。
[0047] 试验菌种
[0048] 黑曲霉，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（编号：2330~2335)。
[0049] 种子培养基
[0050] 自来水与玉米粉按质量比5 :2的比例混合，110°C保温并不断搅拌，并加入α -高 温淀粉酶，恒温30min，用碘指示剂检验不变蓝，即糖化完全，冷却，回复原来体积，得到玉米 粉糖化液。
[0051 ] 将玉米粉糖化液经两层纱布过滤得糖化清液。
[0052] 用盐酸调节pH值到4. 5~5. 0,在摇瓶中加入玉米粉糖化液，纱布封口，121 °C灭菌 25min，得种子培养基。
[0053] 种子培养基设计4个梯度试验，分别为在上述种子培养基基础上不添加甜菜碱得 到1*种子培养基、添加〇. 6g/L的甜菜碱得到2*种子培养基、添加0. 8g/L的甜菜碱得到3* 种子培养基、添加 lg/L的甜菜碱得到4*种子培养基。
[0054] 培养条件
[0055] 将在土豆斜面培养基上生长成熟的黑曲霉，在无菌条件下，采用孢子悬浮液接种 法接种，对孢子进行计数，调整种子培养基中孢子接种量为5. 0X IO5个，将同等数量的孢子 分别接种到上述4个种子培养基中，置于旋转式摇床上，160r/min，34± 1°C，培养22h。
[0056] 实验结果
[0057] 甜菜碱添加量对种子培养基菌团形成率的影响
[0059] 由上表可以看出，在种子培养阶段，随着甜菜碱添加量的增加，总菌球数也增加。
[0060] 发酵培养基
[0061] 将玉米粉糖化液与过滤后的玉米糖化清液按体积比1 :5的比例混合。
[0062] 在全自动发酵罐中加入混合后的培养基，添加 0. 3% (重量百分比）的（NH4)2SO4, 调pH值到4. 5~5. 0。
[0063] 采用4个发酵罐，其中1#和3#发酵罐不添加甜菜碱，2#和4#发酵罐分别添加 2. Og/L的甜菜碱。115°C灭菌25min灭菌，得到4罐发酵培养基。
[0064] 发酵条件
[0065] 将两份等量的1*种子液分别转接到1#和2#全自动发酵罐中，将两份等量的4* 种子液分别转接到3#和4#全自动发酵罐中。
[0066] 发酵开始时，分别在温度为34±1°C下通气培养。在培养过程中，采用液氨调节培 养基的pH，使pH值维持在4. 4~4. 8。发酵培养72小时后，发酵完毕。
[0067] 发酵过程中，分别在36h，48h，60h，66h，72h检测柠檬酸产量。采用0. 1429mol/L 的氢氧化钠溶液滴定法测定柠檬酸。
[0068] 实验结果如图1所示。
[0069] 从图1可以看出，只在发酵培养基中添加甜菜碱的2#罐的产酸率比对照1#罐提 尚约7. 0 %。
[0070] 只在种子培养基中添加甜菜碱的3#罐的产酸率比对照1号罐提高约3. 8%，同时 发酵周期72小时缩短到66小时。
[0071] 在种子培养基和发酵培养基中同时添加甜菜碱的4#发酵罐比对照1#发酵罐，产 酸率提高约10. 8%，同时产物合成速率明显提升，发酵周期从72小时缩短到60小时。
[0072] 在本说明书的描述中，参考术语"一个实施例"、"一些实施例"、"示例"、"具体示 例"、或"一些示例"等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特 点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不 必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任 一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技 术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结 合和组合。
[0073] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例 性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述 实施例进行变化、修改、替换和变型。
【主权项】
1. 一种制备巧樣酸的方法，其特征在于，包括W下步骤： 步骤S1:种子培养阶段 1) 种子培养基 自来水与玉米粉按质量比5:2的比例混合，110°C保溫并不断揽拌，并加入α-高溫淀 粉酶，恒溫30min，用舰指示剂检验不变蓝，即糖化完全，冷却，回复原来体积，得到玉米粉糖 化液； 将玉米粉糖化液经两层纱布过滤得糖化清液； 用盐酸调节抑值到4. 5~5.0,在摇瓶中加入玉米粉糖化液，纱布封口，121°C灭菌 25min，得种子培养基； 2) 种子培养条件 将黑曲霉（2330~2335)菌种按照接种量为5. 0X105个抱子接种到种子培养基中，置 于旋转式摇床上，在转速16化/min、溫度34+rC的条件下，进行培养22hW得到种子液； 步骤S2:发酵产酸阶段 1) 发酵培养基 将玉米粉糖化液与糖化清液按体积比1 :5的比例混合；在全自动发酵罐中加入混合后 的培养基，添加0. 3% (重量百分比）的（畑4)25〇4,调抑值到4. 5~5. 0，115°C灭菌25min， 得到发酵培养基； 2) 发酵条件 将步骤S1中得到的种子液加入到发酵培养基中进行发酵W生成巧樣酸，发酵时，在溫 度为34+rC下通气培养，采用液氨调节培养基的抑，使抑值维持在4. 4~4.8,发酵培养 72小时后，发酵完毕； 其中，所述种子培养基和所述发酵培养基中均包括通式（1)化合物中的至少一种；(0 所述通式（1)化合物中的R为。~〇2。烷基，所述通式（1)化合物在所述种子培养基 和所述发酵培养基中的浓度均为0. 15~7g/L。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述通式（1)化合物中的R为C1~C12烧 基。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述通式（1)化合物为甜菜碱、月桂基甜 菜碱、辛基甜菜碱或异丙基甜菜碱。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述通式（1)化合物为无水甜菜碱、一水 甜菜碱、盐酸盐甜菜碱或憐酸甜菜碱。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述通式（1)化合物在所述种子培养基和 所述发酵培养基中的浓度均为0. 5~5g/L。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述通式（1)化合物在所述种子培养基中 的浓度为0.6~Ig/l，所述通式（1)化合物在所述发酵培养基的浓度为2g/L。
【专利摘要】根据本发明实施例的制备柠檬酸的方法，包括以下步骤：步骤S1：种子培养，将柠檬酸发酵菌种接种到种子培养基中进行培养以得到种子液；步骤S2：发酵产酸，将步骤S1中得到的种子液加入到发酵培养基中进行发酵以生成柠檬酸；其中，所述种子培养基和所述发酵培养基中均包括通式(1)化合物中的至少一种；所述通式(1)化合物中的R为C1～C20烷基。根据本发明实施例的制备柠檬酸的方法，种子培养基和所述发酵培养基中均包括通式(1)化合物中的至少一种，从而提高柠檬酸生产速率，缩短发酵时间，最终提高柠檬酸产量并降低能耗。
【IPC分类】C12P7/48, C12R1/685
【公开号】CN105400834
【申请号】CN201610009560
【发明人】马兴群, 刘雨, 宋琦, 毛秀立, 陈玉霞, 陈霞
【申请人】山东祥维斯生物科技股份有限公司
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2016年1月8日