。云南省在2001-2005年五年间疟疾平均发病率为 3. 05/万，其中大部分为间日疟（73.41%)。云南省内部的疟疾分布是不均匀的，其中与中 緬边境交界的地区是疟疾发病高风险区之一。緬甸拉咱市是中緬边境的一个小城市，位于 緬甸克钦邦第二特区，与我国云南省盈江县仅有一河之隔，两地交通便利。双方务工人口的 涌入与回归，使当地成为输入性疟疾的主要疫源地。因此，对这些交界地区进行密切监测和 主动侦查疟疾发病情况是疟疾防治工作的重点。自2007年起，我国卫生部与英国无国界卫 生组织联合开展"中緬边境疟疾联防联控项目"，在中緬边境各诊疗点和流动医疗组开展疟 疾现场流行病学调查和重点联防联控。
[0010] 最新的G6H)突变基因型的数据库共包括186种基因变异体（gene variants)， 参见 Minucci A,Moradkhani K,Hwang MJ, Zuppi C,Giardina B,Capoluongo E: Glucose-6-phosphate dehydrogenase(G6PD)mutations database : review of the〃old〃and update of the new mutations. Blood Cells Mol Dis 2012,48:154-165。 G6ro突变基因型的频率在不同国家，不同人群，以及同一民族不同地区存在很大差异。 Weiying Jiang等人对我国来自11个民族的一千余人进行了 G6H)基因型分析，检测 到14个突变位点，这些位点在不同的少数民族间突变频率有很大的差异，研究同时发 现我国的人群G6H)突变基因型不同于非洲、欧洲及印度人群，参见Jiang W，Yu G，Liu P, Geng Q, Chen L, Lin Q, Ren X, Ye ff, He Y, Guo Y, et al:Structure and function of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient variants in Chinese population. Hum Genet 2006, 119:463-478。我们总结了大量文献报道，汇总了我国最常见的23种G6H)突 变基因型（见表1)，其中有些位点在我国人群中已经达到多态性的频率（polymorphic)。
[0011] 我们采用的 G6PD 的 cDNA 在 GenBank 中序列标识符为 X03674 (version:X03674. 1 GI: 31542)，gDNA 为 X55448 (version:Χ55448·1 GI :450527)。起始密码子 ATG 中的 A 编号 为+1。由于数据库的更新，为了标准化和统一这些序列，建立统一的起始密码用于基因比 对，需要从GenBank cDNA的序列中减去470个核苷酸，基因组DNA序列中减去3350个核苷 酸。在本发明的实施方式部分检测了以下23个G6H)基因突变位点。
[0012] 表1我国最常见的23个G6H)基因突变位点.
[0013]
[0014] 23个突变位点，包括24个基因型，其中835位点可能从A突变为T或G ;/表示该 突变位点有多个名字。
[0015] 现有的Gero基因突变检测技术及局限
[0016]目前鉴定Gero缺乏基因突变的分子学方法主要依赖不同的技术区分等位基 因。常见的G6H)基因突变检测技术有基于PCR的单链构象多态性分析（PCR based single-stranded conformation polymorphism analysis，PCR-SSCP)， 参见 Ainoon 0,Yu YH，Amir Muhriz AL,Boo NY，Cheong SK，Hamidah NH:Glucose-6-phosphate dehydrogenase(G6PD)variants in Malaysian Malays. Hum Mutat 2003,21:101。 基 于 PCR 的反向斑点杂交（PCR based reverse dot blot，PCR-RDB)，参见 Lu X，Hua Lj Zhang T，Li S，Fan X，Peng Q，Li Wj Ye J，Long J，He X:A reverse dot blot assay for the expanded screening of eleven Chinese G6PD mutations. Clin Chim Acta 2013,418:45_49。变性高压液相色谱（denaturing high-performance liquid chromatography, DHPLC)，参见 Wu G，Liang WH，Zhu J，Ouyang H，Pearson P，Cai R，Liao C, Mo QH, Zhu DL, Xu XM:Rapid, simultaneous genotyping of 10 Southeast Asian glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency-causing mutations and a silent polymorphism by multiplex primer extension/denaturing HPLC assay. Clin Chem 2005, 51:1288-1291。限制性片段长度多态性聚合酶链反应（restrictionfragment length polymorphism analysis, PCR-RFLP),参见 Tang TK, Huang CS, Huang MJ, Tam KB,Yeh CH, Tang CJ:Diverse point mutations result in glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) polymorphism in Taiwan. Blood 1992, 79:2135-2140,高分辨率溶 解曲线（high-resolution melting, HRM)，参见 Wu G，Liang WH, Zhu J, Ouyang H, Pearson P, Cai R, Liao C, Mo QH1Zhu DL, Xu XM: Rapid, simultaneous genotyping of IOSoutheast Asian glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency-causing mutations and a silent polymorphism by multiplex primer extension/denaturing HPLC assay. Clin Chem 2005,51:1288-1291 ;Pan M，Lin M，Yang L，Wu J，Zhan X，Zhao Y，Wen Y，Liu G，Yang L, Cai Y:Glucose_6-phosphate dehydrogenase(G6PD) gene mutations detection by improved high-resolution DNA melting assay. Mol Biol Rep 2013,40:3073-3082。 基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱法（matrix assisted laser desorption/ ionization time-〇f-flight mass spectrometry, MALDI-T0F MS),参见Zhao F, Ou X_L, Xu C-C, Cai G-Q, Wu X-Y, Huang Y_M, Zhu ff-F, Jiang Q-C: Rapid detection of six common Chinese G6PD mutations by MALDI-T0F MS. Blood Cells, Molecules, and Diseases 2004,32:315-318以及直接测序等等。尽管每种技术都有其独特的优点，然而，这些技术对 于人群大规模筛查G6H)基因多重突变位点也存在一些局限。
[0017] PCR-SSCP
[0018] PCR-SSCP是最常用的一种简单快速的点突变筛查方法，其基本原理是PCR扩增目 的片段后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)区分有突变的单链DNA。仅有单个碱基的突变 就可以影响DNA的立体构象，而不同的立体构象会影响DNA电泳迁移率，产生不同的电泳 带，进而区分突变与正常。但是，SSCP筛查仅能够检测到突变是否存在，还需要随后的DNA 测序才能知道具体的突变位点；而且该方法最大的局限是很难标准化，不同的杂交条件，洗 脱条件（凝胶类型、电泳缓冲液、温度）对单链DNA影响都很大，这就造成方法的稳定性较 差，有可能出现检测结果的假阴性或假阳性，不易临床推广应用。
[0019] PCR-RDB
[0020] PCR-RDB是将等位基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide, AS0)固定在尼龙膜上，通过ASO中部的等位基因特异的碱基与革El序列 DNA严格杂交配对来检测突变位点。RDB用于基因分型具有无放射性，对设备和技术要求 低，便于推广的特点，然而由于其检测结果需要人工判读和报告，这就限制了其在临床大规 模人群筛查中的应用。
[0021] MALDI-T0F MS
[0022] MALDI-T0F MS是一种高准确度，高分辨率的基因分型或单核苷酸多态性位 点（Single Nucleotide Polymorphism, SNP)检测的技术。其基本原理是多重PCR扩 增目的片段后，以PCR产物作为模板，用位点特异的引物进行单碱基延伸（single base extension，SBE)，延伸后的产物具有不同的质量（mass)，通过质谱进行检测和区分多重等 位基因突变（或SNP位点）。由于质谱信号准确度高，信噪比（signal-to-noise ratio, SNR) 高的特点使得到的结果假阳性率很低，而且操作方法标准化，检测结果直接由机器判读给 出，方便临床检测使用，优于之前的检测技术。同时，该方法的引物无需荧光等化学修饰，可 以检测多重突变位点（或SNP位点）。
[0023] 基于此技术的商品化iPLEX Gold Assay (Sequenom, CA)联合了应用自动点样仪和 384个样品的芯片，实现了中等通量的基因分型。然而，尽管该技术PCR后的质谱检测准确 度高，速度快，但PCR之前样品的提取和处理成为该方法应用于大规模人群筛查的一个"瓶 颈"。同时，该方法在检测多个突变时依赖多重PCR扩增靶位点，多重PCR存在引物设计复 杂、扩增效率低、不同模板间扩增效率不同等问题，而且随着检测突变