Test，RDT)均未查到疟疾感染。所有被采样者均志愿参加并签署知情同意书。 所有血样均按照WHO标准操作规范，将75 μ 1抗凝静脉全血点在Whatman 903滤纸规定的 圈内，过夜干燥（或至少干燥4小时），每个纸片分别包于密闭塑料袋中，加入适量硅胶干燥 剂，储存于_8〇°C待用。
[0062] MELPA技术用于检测G6H)基因的23个突变位点
[0063] 探针设计
[0064] 表2 =MELPA用于G6H)基因23个突变位点检测的所有探针、通用引物序列以及PCR 后扩增产物的长度
[0065]
[0068] 其中捕获探针（CP探针）在3 '端连接一段序列和以共价键结合在捕获载体表面 的寡核苷酸序列互补。
[0069] 采用本领域已知的方法，对所有合成的连接探针LP2进行磷酸化修饰。将所有的 LP1，LP2, CP1，CP2探针核酸干粉用DI H20稀释备用。
[0070] 样品制备
[0071] 该方法检测的样品包括全血样品和干血片（DBS)样品。干血片（DBS)样品是临床 检测以及流行病学人群研究中最常见的样本。与全血相比，DBS样品用血量少，样本采集、 运输和储存成本更低，也更容易。
[0072] 我们用MELPA检测序列已知的同一样本的全血样本和DBS样本。配置如下裂 解液裂解血液样品或干血片样品：3X裂解液50 μ I ;20mg/ml蛋白酶K，7. 5 μ I ;DI H20， 56. 5 μ I ;LP探针混合物（0.1 uM/各种），I. 5 μ I ;CP探针混合物（0.1 uM/各种），I. 5 μ I ; 逆转录（IOuM)，3 μ 1。
[0073] 过夜孵育捕获
[0074] 将上述裂解后产物加至已共价包被了捕获用寡核苷酸序列的捕获载体 (Diacurate公司，产品号Cat#12000)。每孔100μ 1，置于PCR仪上98°C 5min充分热变性 DNA，55°C过夜孵育（>16小时）。
[0075] 延伸连接反应
[0076] 在如下混合液中，在冰上配置延伸连接反应：DI H20,43 μ 1/孔；10XNEB缓冲液， 2μ 1/孔；IOmM dNTP，0. 5μ 1/孔；100XBSA，0. 5μ 1/孔；Τ4 DNA连接酶，0· 5μ 1/孔；Τ4 DNA 聚合酶，0.5 μ 1/孔。
[0077] PCR
[0078] 在 95°C，2min ;而后 45 个循环的 95°C，30s、56°C，30s、72°C，60s ;以及 72°C，5min 进行PCR。PCR引物序列为SEQ ID No 52, 53。
[0079] 用好喊性憐酸酶（Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP)去除未反应的 dNTP。
[0080] UEP单碱基延伸
[0081] 设计适用于MELPA的UEP见表3,由于一些G6H)突变位点距离较近，将UEP分成两 孔1和2两个反应孔。延伸反应在如下条件下进行：94°C，30s ;40个循环的94°C，5s、52°C， 5S、80°C，5s ;72°C，3min ;4°C，维持。UEP质量以及引物延伸后的质量等详细信息见表4。
[0082] 表3 :MELPA中针对G6TO突变位点的UEP引物
[0084] 表4 =MELPA用于G6H)基因常见23个突变位点检测的质谱信
[0086] AMP_LEN :扩增产物长度；UEP_DIR :UEP方向；EXT_CALL:UEP延伸的位点信息； EXT_MASS :UEP延伸后产物质量。
[0087] 树脂纯化
[0088] 树脂纯化是必须的步骤，树脂可以去除多余的盐离子，这些多余的盐离子可能引 起数据获取中出现假的质谱峰，影响检测结果。
[0089] 点样仪点样至芯片以及质谱检测与分析
[0090] 按照Sequenom公司标准操作MassARRAY Typer 4. 0软件进行质谱检测，
[0091] 得到每个等位基因位点的检测结果，并且质谱给出对结果可信度的描述分为A~ D四个等级，见表5。本实验的结果判读中，当结果描述为A级和B级时，为实验结果可信， C级实验结果可信度较低，需要进一步观察峰图根据SNR值判读结果，未延伸的峰高度为0， 延伸后主峰SNR>6. 4可以认为质谱结果中度可信。
[0092] 表5:实验结果
[0094] 2、iPLEX方法用于检测23种G6H)基因型
[0095] 登陆SEQUEN0M公司在线设计网站（https://mysequenom. com),选择基因分型在 线设计工具（Human GenoTyping Tools)。将G6H)基因组序列检测靶位点输入后软件将 自动设计出扩增引物和延伸引物（unexteneded primer, UEP)。由于G6FO基因很多突变 位点距离较近，为了避免扩增引物和UEP有重叠序列导致形成异源二聚体，iPLEX软件设 计时自动将G6H)的23个突变位点分成4个反应孔检测，扩增引物和UEP序列见表6。同 时，为了打质谱时UEP与PCR扩增引物的质量可以区分开来，PCR所有上下游引物均加了 5' ACGTTGGATG3'的10 mer的尾巴。扩增产物长度、扩增方向、UEP mass以及引物延伸后 的mass等详细信息见表7。设计好后，送去公司合成引物和UEP。
[0096] 表6 :iPLEX assay针对G6H) 23个突变位点的扩增引物和UEP的序列
[0100] 孔表示4个独立反应孔；正向PCR引物和反向PCR药物为PCR扩增上下游引物； UEP为单碱基延伸反应中使用的延伸引物，UEP 5'端的小写字母是为了使打质谱时UEP的 质量可以区分开，软件设计时所增加的碱基。
[0101] iPLEX方法如下进行：使用QIAGEN试剂盒提取全血基因组DNA ;在95°C，2min ;而 后 45 个循环的 95°C，30s、56°C，30s、72°C，60s ;以及 72°C，5min 进行 PCR 反应；SAP 处理可 以去除未完全反应的dNTP ;UEP单碱基延伸反应,如上所述进行；树脂纯化后，点样,进行质 谱分析。详细信息见表7。
[0102] 表7 :iPLEX Gold assay用于G6H)基因常见23个突变位点检测的质谱信息
[0104] AMP_LEN :扩增产物长度；UEP_DIR :UEP方向；EXT_CALL: UEP延伸的位点信息； EXT_MASS :UEP延伸后产物质量。
[0105] 3、G6H)基因突变位点的DNA测序
[0106] 在分析的23个G6H)突变位点附近设计引物，进行PCR扩增，送公司进行测序验证 MELPA方法检测结果。引物的设计采用Primer 3在线软件，引物序列、PCR产物长度以及 PCR产物包含的突变位点见表8。
[0107] 表8 :Sanger测序引物、PCR产物长度以及扩增产物所覆盖的G6H)基因突变位点
[0109] 按如下程序进行PCR扩增，94°C，30s ;35个循环的56°C，30s ;72°C，60s ;最后， 72°C 5min。用正向引物或者反向引物进行Sanger测序，验证MELPA或iPLEX基因分型结 果。
[0110] 4、MELPA检测G6H)基因常见23个位点的可靠性
[0111] 4. I MELPA检测结果与金标准测序结果对比
[0112] 我们用MELPA方法检测了 112例间日疟血样G6H)基因这23个位点的基因型，共 找到10个发生突变的位点，来自于9例样品，其中有1例样本检测到两个突变位点，检测结 果见表9。我们发现最常见的突变发生在487位点，而且所有杂合子突变的样本均来自女 性。
[0113] 表9 :MELPA方法检测到的有突变位点的样本信息以及测序结果.
[0114]
[0116] 为了进一步验证MELPA检测结果是否可信，我们对上述9个样本检测到的10个突 变位点进行金标准测序验证。测序结果与MELPA检测结果结果一致，一致率为100%
[0117] 4. 2 MELPA与iPLEX方法检测结果对比
[0118] 我们从112例间日疟血样中随机抽取1例间日疟血样和1例正常对照血样分别用 iPLEX方法和MELPA方法检测了 G6H)基因23个突变位点，每个样品均做复孔。总结iPLEX 结果见表10,同样的样本用MELPA方法结果见表11，基因分型的结果描述（Description) 为质谱仪根据峰图自动给出的，表示所得到的基因分型结果的可信程度。举例说明四种级 别的结果描述所相应的峰图，A级别和B级别的基因分型结果可信，C级别的结果需要进一 步观察峰图确定分型结果是否可信，D级别结果不可信。我们可以发现iPLEX方法两个样 本的大多数突变位点检测结果较好，其中间日疟血样有159、517和825三个突变的复孔间 未重复出相同的检测结果，正常血样有517、392和825三个突变的复孔间检测结果重复性 不好，复孔间一致率约为87% (20/23) ;MELPA方法两个样品的23个位点检测结果均较好， 结果描述均为A和B级结果可信，未检测到突变，所有位点均为野生型，复孔间重复性较好， 一致率为100%。
[0119] 此外，为了避免扩增引物和UEP探针之前的相互影响，iPLEX检测这23个突变位 点时，需要4个独立的反应孔，而MELPA仅需2个反应孔可检测所有的23个突变位点，将试 剂和耗材成本缩小了 50%。
[0120] 表10 : iPLEX方法检测间日疟血样和正常对照血样
[0121]
[0123] v表示间日疟，η表示正常对照，数字为样本编号。
[0124] 表11、MELPA方法检测间日疟血样和正常对照血样
[0126] v表示间日疟，η表示正常对照，数字为样本编号。
[0127] 我们将两个血样分别提取基因组DNA，PCR扩增四个不一致的位点159、517、392和 825附近的片段，测序检测到的样品位点基因型。我们发现正常样本和间日疟血样的这四个 位点均为单峰，即均为野生型纯合子。总结对比两种检测方法和测序金标准的结果，可知这 两例样本四个位点用MELPA检测出的结果与金标准测序结果完全一致，且复孔间重复性较 好；而iPLEX方法复孔间重复性较差，检测结果与金标准测序结果不完全一致（参见表12 和 13) 〇
[0128] 表12 :对比间日疟样品（v-6) iPLEX方法和MELPA方法结果与测序结