果
[0130] 表13 :对比正常血样（n-2)的iPLEX方法和MELPA方法结果与测序结果
[0132] 4. 3 MELPA 的重复性
[0133] 为了验证MELPA方法的重复性，我们在112例间日疟血样中随机抽取16例血样在 不同的两个日期进行重复检测，详细的检测结果见附录5。16例样品均检测G6H)基因的23 个突变位点，共检测368个位点（23*16)，其中有4例样品各有1个位点在两次的检测中， 有一次未给出基因型分型的结果（NA.质谱信号较低，机器未读出检测结果），占总检测位 点的1.08% (4/368);其余所有位点的结果在两个不同日期基因分型结果均一致，成功检 测364个位点占98. 9% (364/368)，即一致率为98. 9%。MELPA方法针对同一样本在不同 日期检测结果的重复性较好。
[0134] 4. 4 MELPA对临床样本的适用性
[0135] 经过SNP预实验，我们发现MELPA既可以直接检测全血，也可以直接检测干血片 (DBS)样本，两种样本均无需提取基因组DNA，通过直接裂解捕获样本中的DNA进行检测。我 们将G6H)突变分型的检测方案应用于这两种样本较大的样本量中，进一步评估该检测方 案对两种临床样本的适用性。
[0136] 4. 4.1全血样本
[0137] 对于基因突变分型或SNP检测，检出率（Call Rate)是一个很重要的指标。质谱 检测的结果中，检出率定义为质谱给出的分型结果占总的检测位点的百分比（Call Rate = Calls/Total Possible Calls)。我们用MELPA方法总共检测了 112例间日疟全血样 本。每个样本均分析了 G6H)基4. 4. 1因的23个常见突变位点，共2576个位点（23*112)。 其中质谱给出的分型结果（包括A~C级别的结果）的有2520个，即Call Rate为 97.83% (2520/2576)，未能得到分型结果（包括D~I级别的结果）的有56个，占2. 17% (56/2576)。
[0138] MELPA检测血样G6H)基因分型的详细结果表明，A级别的结果有2380个占 92. 39% ;B的有128个占4. 97%，即A和B级别可信的结果共占所有质谱给出分型结果的 97. 36% (2508/2576) ;C与D级别，尽管得到分型结果，但结果可信度不高，共有43个位点， 占1.67%。我们可以发现MELPA方法用于检测全血样本，Call Rate超过97%，可信分型 结果（A和B级别）比例大于97%，该方法可以很好地适用于全血样本的直接检测。
[0139] 此外，112例样本中有6例样本未能成功检测所有的23个位点，这些样本的23 个位点中有5个以上的位点未得到分型结果（D~I级别的结果），占样本比例的5. 36% (6/112)，这可能是由于这些血样存储时间较久，个别样品DNA降解所致。
[0140] 4. 4. 2 干血片样本（DBS)
[0141] 我们用MELPA方法总共检测了 192例DBS样本，每个样本均检测了 G6H)基因的23 个常见突变位点，共4416个位点（23*192)。其中质谱给出的分型结果（包括A~C级别的 结果）的有4295个，即Call Rate为97. 26% (4295/4416)，未能得到分型结果（包括D~ I级别的结果）的有121个占2. 74% (121/4416)。
[0142] MELPA检测DBS样本的G6H)基因分型详细结果表明，A级别的结果占91.03% ; B级别占5. 8 7 %，即A和B级别可信的结果共占所有质谱给出分型结果的96. 90 % (4279/4416) ;C与D级别，尽管得到分型结果，但结果可信度不高，共占0.79%。我们可以 发现MELPA方法用于检测DBS样本，Call Rate超过97%，可信分型结果（A和B级别）比 例约占97%，该方法对于DBS样本的基因分型适用性良好。
[0143] 此外，所有的N级别（没有特异单碱基延伸后产物）和I级别（未得到质谱峰） 的结果集中于8个样品；这些样品的23个位点有10个以上的位点未得到成功的检测结果， 占样本比例的4. 12% (8/192)。
[0144] 4. 5 MELPA技术在疟疾流行区G6H)基因突变筛查中的应用
[0145] 4. 5. 1中緬边境间日疟血样G6H)基因23个突变位点的筛查与分布
[0146] 我们用MELPA方法成功检测了中緬边境106例伯氨喹啉用药的间日疟血样G6H) 基因的23个常见突变位点，其中男性78例，女性28例，平均年龄20. 1岁，检测样本的民族 分布见表14,主要以景颇族为主，占66. 98 % (71/106)，其次为緬族占28. 3 % (30/106)，傈 傈族、汉族和傣族共占4. 72%。
[0147] 106例血样中共检测到9例样本发生突变，人群突变发生频率约为8. 5% (9/106); 各民族检出突变类型、突变例数以及突变例数占该民族总检测人数的百分比见表。其中，景 颇族检出突变频率为8. 5% (6/71)，緬族为6. 7% (2/30)，傣族为100% (1/1)，傈傈族和汉 族未检测到突变，见表14。
[0148] 共检测到10个突变位点，其中有1例患者发生两个位点的杂合突变，相应的样本 信息见表15,其中所有的杂合突变均为女性，纯合突变均为男性（半合子）。突变位点的频 数以及频率分布见表16,其中最常见的突变位点为玛希隆（c. 487G->A)，突变发生频率为 6. 6% (7/106);开平（c. 1388G->A)，万象（c. 871G->A)和庆安（c. 392G->T)各检测到 1 例， 突变频率为0.94% (1/106)。
[0149] 表14 :106例间日疟血样的民族分布、检出突变类型以及突变例数（百分比）
[0151] --表示未检测到突变
[0152] 表15 :10个G6H)突变位点的样本信息
[0154] /表示该突变位点有多个名字。
[0155] 表16 :中緬边境106例间日疟血样的G6H)变体分布
[0157] /表示该突变位点有多个名字.
[0158] 106例间日疟血样中，有75例采用我国氯伯8d疗法，有31例采用WHO推荐的氯伯 8d疗法。所有样本中仅有1例（ID: vA-8)发生急性溶血反应，该样本为男性，19岁景颇族， 采用我国氯伯8d疗法后3天出现血红蛋白尿。检测该样本G6H) 23个突变位点中只有玛 希隆（c. 487G->A)位点发生突变，为玛希隆半合子，其余22个突变位点均未突变，所有检测 结果均为A级别和B级别的可信结果。
[0159] 4. 5. 2云南省疟疾流行区G6H)基因23个突变位点的筛查与分布
[0160] 在检测了 106例中緬边境伯氨喹啉用药的间日疟血样后，我们又用MELPA方法成 功检测了云南省疟疾流行区的184例DBS样本的G6H)基因23个常见突变位点，其中男性97 例，女性87例，平均年龄22. 6岁，检测样本的民族分布见：，主要以拉祜族为主，占58. 7 %， 其次为佤族占25. 54%，其余少数民族共占15. 76%。
[0161] 184例DBS样本中共检测到2例样本发生突变，人群突变发生频率约为1. 1% (2/184);各民族检出突变类型、突变例数以及突变例数占该民族总检测人数的百分比见表 17,其中2例样本均为拉祜族，拉祜族检出突变频率为1. 8% (2/108)，其余少数民族未检出 突变；检测到2个突变类型相应的样本信息见表18,其中玛希隆（c. 487G->A)杂合突变为 女性，巴利亚多利德（c. 406C->T)纯合突变为男性（半合子）。
[0162] 表17 :184例DBS样本的民族分布、检出突变类型以及突变例数（百分比）
[0163]
[0164] --表示未检测到突变
[0165] 表18 :2个G6H)突变位点的样本信息
【主权项】
1. 一种基于多重延伸连接的探针扩增方法，所述方法包括以下步骤： a) 提供含有待检测核酸的样本； b) 使用含有蛋白酶K的裂解液裂解含有待测核酸的样本； c) 在足以使互补碱基杂交的条件下，将步骤b)获得的裂解样本与捕获探针以及连接 探针孵育，所述捕获探针结合至捕获载体表面； d) 在足以使延伸反应和连接反应发生的条件下，使与待检测核酸互补杂交的连接探针 延伸并连接； e) 使用PCR扩增延伸连接的连接探针之间的序列。2. 根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)中使用至少一对捕获探针和至少一对连接 探针，所述一对连接探针之一的5'端被磷酸化修饰、3'端具有与通用引物的反向引物互补 的序列；所述一对连接探针的另一个的5'端具有与通用引物的正向引物相同的序列。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中捕获探针的一端带有一段序列，其与以共价键 结合在捕获载体表面的寡核苷酸序列互补，并通过碱基配对与该寡核苷酸序列结合，另一 端通过互补碱基与待检测核酸杂交。4. 根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述捕获载体是固相支持物，优选是96 孔平板。5. 根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述的含有待测核酸的样本是全血或干 血片。6. 根据权利要求1至5任一项所述的方法，进一步包括步骤： f) 通过树脂纯化步骤e)中扩增后的产物； g) 通过质谱、测序、或凝胶电泳的方法检测待检测核酸的序列、碱基突变以及DNA拷贝 数。7. 根据权利要求1-7任一项的方法，用于高通量检测基因组中的SNP、基因插入、基因 缺失的用途。8. 根据权利要求1-7任一项的方法，用于高通量检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因SNP 的用途。9. 一种用于本发明的权利要求1-8任一项所述的方法试剂盒，所述试剂盒包含至少一 对捕获探针和至少一对连接探针，以及捕获载体。10. -种用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因SNP的试剂盒，所述试剂盒包含选自序列 为SEQIDNO: 1-51所示的寡核苷酸以及捕获载体。
【专利摘要】本发明涉及一种基于多重延伸连接的探针扩增方法、其用途和试剂盒。进一步地，本发明涉及本发明的基于多重延伸连接的探针扩增方法用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因SNP的用途以及用于本发明的方法的试剂盒。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105400863
【申请号】CN201410468340
【发明人】郑直, 田晓怡, 程志斌
【申请人】中国医学科学院基础医学研究所
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2014年9月15日