一种安乃近代谢物检测用半抗原及其快速检验装置及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种安乃近代谢物检测用半抗原及其快 速检验装置及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 安乃近(dipyrone)，属于吡唑酮类解热镇痛药，是临床常用的热镇痛药之一。安乃 近在体内可迅速水解成活性产物4-甲基氨基安替比林，产生药理作用，4-甲基氨基安替比 林在体内代谢为4-甲酰胺基安替比林和4-氨基安替比林。由于安乃近解热效果确切，在许 多国家都被广泛使用，投入临床应用已有百年历史。但由于该药导致粒细胞减少，再生障碍 性贫血，严重的过敏和休克虚脱等严重的不良反应，世界上一些发达国家已经做出了停止 或限制使用安乃近的规定，如美国、瑞典禁止该药用于食源性动物中，欧盟对食源性动物组 织中安乃近限量的要求为l〇〇yg/kg(以安乃近代谢物含量计算），我国对安乃近在食源性动 物组织中的限量为200yg/kg。
[0003] 在兽医领域，安乃近主要作为一些严重疾病的辅助对症药物。由于其解热镇痛疗 效确切，价廉易得，经常被长期过量使用，且由于不严格遵守休药期等原因，容易在动物体 内产生积蓄残留，进而危害人类的生命健康。
[0004] 目前，检测安乃近代谢物残留的方法主要有:分光光度法、流动注射化学发光光度 法、薄层色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等。分光光度法、流动注射化学发 光光度法和薄层色谱法具有测定速度快、样品通量大和检测成本低等优点，但容易受基质 中与目标化合物化学结构相似的化合物的干扰而影响检测结果的准确性。高效液相色谱法 与液相色谱-串联质谱法具有更好的准确性、灵敏度和重复性。但都需要仪器，有的还很昂 贵，耗时也较长，前处理复杂，需要专业人员进行操作与维护。
【发明内容】
[0005] 针对以上技术问题，本发明公开了一种安乃近代谢物检测用半抗原及其快速检验 装置及其制备方法，针对现有检测安乃近技术的不足，建立一种检测安乃近残留的快速方 法，使其能更加快速、灵敏、简便地检测安乃近残留，满足了安乃近代谢物残留快速检测的 需要，给食品安全提供重要手段。
[0006] 对此，本发明采用的技术方案为：
[0007] -种安乃近代谢物检测用半抗原，其具有式(1)所示的化学结构式：
[0008] p
[0009] 上述化学结构式的化学名为丨，5-二甲基-3-羰基-2-苯基-2,3-二氢-1H-吡唑-4-氨基）乙酸;其分子量为261，其MS母离子峰为261.7:其熔点为115-122°C。
[0010] 作为本发明的进一步改进，所述安乃近代谢物检测用半抗原采用以下步骤制备得 到：
[0011]步骤S1:将4-氨基安替比林与溴乙酸丁酯在碱性催化剂的作用下，于100-110°C下 反应，得到中间产物;其中，所述碱性催化剂优选为碳酸钾。
[0012] 步骤S2:在中间产物中加入三氟乙酸，在pH值为6.5~7.5下反应得到如式⑴所示 的结构式的安乃近代谢物检测用半抗原。
[0013] 作为本发明的进一步改进，所述步骤A的反应在溶剂中进行，所述溶剂为二甲基甲 酰胺。
[0014] 作为本发明的进一步改进，所述步骤B的反应在二氯甲烷溶剂进行。
[0015] 进一步优选的，采用如下反应路线制备安乃近代谢物检测用半抗原：
[0016]
[0017] 制备所述安乃近代谢物检测用半抗原的步骤为：
[0018] (1)在4-氨基安替比林(反应物1)中，加入碳酸钾与二甲基甲酰胺(DMF)，105°C下 搅拌lOmin后，加入5g溴乙酸丁酯（反应物2)，搅拌过夜后，将混合物减压蒸干，用水洗涤后 用乙酸乙酯萃取，再次蒸干后，过硅胶柱纯化后再次蒸干得到中间产物1。
[0019] (2)向中间产物1中加入二氯甲烷和三氟乙酸（TFA)，搅拌3~5h，蒸干溶剂，加入 NaOH溶液调节pH至6.5~7.5后，用乙酸乙酯反复萃取，蒸干即得到4-氨基安替比林衍生物， 即安乃近代谢物检测用半抗原。
[0020] 本发明还公开了一种安乃近代谢物检测用抗原，采用如上所述的安乃近代谢物检 测用半抗原制备得到，将所述安乃近代谢物检测用半抗原与BSA溶于pH值为9.0的碳酸缓冲 溶液，并加入碳二亚胺，搅拌12~24h，透析纯化，得到安乃近代谢物检测用抗原4-氨基安替 比林衍生物-BSA;即利用碳二亚胺法，将所述安乃近代谢物检测用半抗原与载体蛋白牛血 清偶联，得到4-氨基安替比林衍生物-BSA，即所述安乃近代谢物检测用抗原。
[0021] 本发明还公开了一种安乃近代谢物检测用单克隆抗体，采用如上所述的安乃近代 谢物检测用抗原4-氨基安替比林衍生物-BSA与免疫Balb/c小鼠经细胞融合，筛选得到分泌 抗4-氨基安替比林衍生物单克隆抗体的杂交瘤细胞，用获得的杂交瘤细胞诱导小鼠产生腹 水，纯化后获得安乃近代谢物检测用单克隆抗体4-氨基安替比林衍生物单克隆抗体。
[0022] 本发明还公开了一种安乃近代谢物的快速检验装置，包括反应杯和检测试纸，所 述检测试纸包括衬板以及衬板上依次粘附包被膜、吸水垫、样品垫，并使得样品垫、吸水垫 分别位于包被膜的两侧;所述反应杯里含有如上所述安乃近代谢物检测用单克隆抗体标记 的胶体金，所述包被膜上喷涂有检测区和质控区，所述检测区采用如上所述的安乃近代谢 物检测用抗原溶液喷制。
[0023] 作为本发明的进一步改进，所述检测区包括直线式隐形检测线T线，所述质控区包 括羊抗鼠IgG溶液喷制的直线式隐形控制线C线，检测线T线和控制线C线相互平行。
[0024] 本发明还公开了一种如上所述的安乃近代谢物的快速检验装置的制备方法，其包 括以下步骤：
[0025] 步骤A:安乃近代谢物检测用半抗原及抗原的制备；
[0026] 将4-氨基安替比林与溴乙酸丁酯在碳酸钾催化剂的作用下，于100_110°C下反应， 得到中间产物;在中间产物中加入三氟乙酸，在pH值为6.5~7.5下反应得到所述安乃近代 谢物检测用半抗原;利用碳二亚胺法将所述安乃近代谢物检测用半抗原与载体蛋白牛血清 偶联，制备得到所述安乃近代谢物检测用抗原；
[0027] 步骤B:安乃近代谢物检测用单克隆抗体的制备；
[0028]用4-氨基安替比林衍生物-牛血清蛋白抗原与免疫Balb/c小鼠，经细胞融合，筛选 得到分泌抗4-氨基安替比林衍生物单克隆抗体的杂交瘤细胞，用获得的细胞诱导小鼠产生 腹水，纯化后获得4-氨基安替比林衍生物单克隆抗体；
[0029] 步骤C:胶体金标记安乃近代谢物检测用单克隆抗体制备金标抗体，胶体金的制 备；
[0030] 用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金;将胶体金与所述安乃近代谢物检测用单 克隆抗体混合形成金标抗体，离心复溶后得到安乃近代谢物检测用单克隆抗体标记的胶体 金；
[0031 ]步骤D:胶体金反应杯、纤维膜的包被；
[0032]将步骤C得到的安乃近代谢物检测用单克隆抗体标记的胶体金分装至微孔反应杯 中，低温干燥;将所述安乃近代谢物检测用抗原与羊抗鼠IgG分别喷涂在纤维膜的检测线和 控制线区域，干燥得到包被膜；
[0033]步骤E:试纸条的组装；
[0034] 将包被膜、吸水垫和样品垫依次在粘附在衬板上组装得到所述安乃近检测试纸。
[0035] 作为本发明的进一步改进，所述的安乃近代谢物的快速检验装置的制备方法还包 括将粘好的所述安乃近检测试纸切成等宽度的试纸条，将所述反应杯及试纸条密封干燥保 存。优选的，采用铝箱袋密封保存。
[0036] 本发明的技术方案，采用胶体金免疫层析方法检测安乃近代谢物提供了一种快 速、简便的安乃近检测方法，这是一种利用胶体金标记单克隆抗体，利用抗原抗体的特异性 结合判断待测样品中被检测物质的含量。其制备方法包括4-氨基安替比林衍生物半抗原及 其抗原的制备，4-氨基安替比林衍生物单克隆抗体的制备，柠檬酸三钠法制备胶体金，在适 当的标记条件下标记4-氨基安替比林衍生物单克隆抗体得到金标抗体，然后离心纯化金标 抗体，接着将纯化好的金标抗体分装至微孔反应杯里，冷冻干燥，同时将包被抗原4-氨基安 替比林衍生物-牛血清蛋白抗原、二抗羊抗小鼠IgG包被在纤维膜上，将干燥好的纤维膜，吸 水垫，样品垫依次有序粘贴在硬质衬板上，制备胶体金试纸条。
[0037] 与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：
[0038] 第一，采用本发明的技术方案，特异性强，检测灵敏度高，准确性高，重复性好，能 更加快速、灵敏、简便地检测安乃近代谢物的残留。
[0039]第二，本发明的技术方案的快速检验装置，具有特异性强，检测灵敏度高，检测限 达到150pbb，检测快速，只需lOmin可完成检验，前处理简单。
[0040]第三，采用本发明技术方案的快速检验装置，检测结果准确性高，重复性好;不需 要任何仪器设备，便于携带，检测成本低;试纸条使用简单，无需专业人士操作;试纸条储存 方便，稳定性好，在室温下至少可以保存六个月。
【附图说明】
[0041 ]图1是本发明一种实施例安乃近代谢物的快速检验装置的组装结构示意图。图中， 1为底板，2为检测线T线，3为控制线C线，4为样品垫，5为包被的硝酸纤维膜，6为吸水垫，7为 层析方向，8为反应杯。
[0042]图2是本发明一种实施例安乃近代谢物的快速检验装置组装好后的结构示意图。 [0043]图3是本发明所述安乃近代谢物检测用半抗原的MS谱图。
【具体实施方式】
[0044]下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
[0045] 实施例1
[0046] 如图1和图2所示，一种安乃近代谢物的快速检验装置，其包括反应杯8(即为金标 微孔)和检测试纸，所述检测试纸包括底板1以及底板1上一端粘附的样品垫4,中间粘附的 包被的硝酸纤维膜5,另一端端粘附的吸水垫6。其中，反应杯8中含有抗4-氨基安替比林衍 生物-胶体金标记物，包被的硝酸纤维膜5上包被了 4-氨基安替比林衍生物-BSA抗原和羊抗 鼠IgG，检测线T线2、控制线C线3位于包被的硝酸纤维膜5上，其中，所述检测线T线采用的安 乃近代谢物检测用抗原溶液喷制，为直线式隐形的检测线T线2;所述控制线C线3采用羊抗 鼠IgG溶液喷制，为直线式隐形的控制线C线3,检测线T线2和控制线C线3相互平行。在检测 时，待测样品溶液按照从样品垫4向另一端的层析方向7进行层析。其中，所述底板1为PVC衬 板。
[0047] 实施例2
[0048] 该试纸条的制备方法包括的步骤如下：
[0049] 步骤A:安乃近代谢物检测用半抗原4-氨基安替比林衍生物及其抗原的制备：
[0050] 按照如下式(2)的合成路线合成所述4-氨基安替比林衍生物。
[00511先称取4g4-氨基安替比林，即式(2)中的反应物1，加入2g碳酸钾与30